前列腺切除术后尿道修复的动物实验

唐小虎罗光恒

1.遵义医学院，贵州 遵义 563003；贵州省人民医院泌尿外科，贵州 贵阳 550002

前列腺切除术后尿道修复的动物实验

唐小虎1罗光恒2

1.遵义医学院，贵州 遵义 563003；贵州省人民医院泌尿外科，贵州 贵阳 550002

目的：探讨前列腺切除术后前列腺部尿道再上皮化来源、过程、机制，以及前列腺部相关干细胞是否参与修复过程。方法：建立2微米激光犬前列腺切除模型，术后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周、12周在膀胱镜下观察前列腺部尿路上皮的修复过程，在创面部位取活检标本，行HE染色以及免疫组化（PSA、CK34、P63、CD133和UPS），在显微镜下观察尿路上皮的修复过程。结果：膀胱镜和显微镜下均未发现前列腺切除术后创面周围正常尿路上皮向创面爬行生长，而尿路上皮再生的主要细胞来源于前列腺细胞。再生的尿路上皮随着修复的进行逐渐表达UPS、P63、CK34、CD133，但不表达PSA。结论：前列腺切除术后前列腺部尿道的再上皮化来自于创面周围正常的尿路上皮可能性小，尿道再上皮化的重要细胞来源可能是前列腺组织细胞，而前列腺部的相关干细胞可能参与修复过程。

尿路上皮；再上皮化；良性前列腺增生；干细胞

良性前列腺增生切除术后前列腺部存在着术后创面、尿道水肿、坏死组织，前列腺部的尿路上皮再生后有助于创面的封闭，使尿道的结构和功能都逐渐恢复至正常。尿路上皮再生是良性前列腺增生术后尿道修复的关键。

传统的观点认为良性前列腺增生切除术后膀胱颈口的正常尿路上皮是前列腺尿路上皮再上皮化的主要来源。但前列腺切除术后的修复方式目前还没有统一的结论，Eduardo［1］等就认为尿道再上皮化的原因是由于残余的腺泡和导管上皮组织增生的细胞迁移而来，同时他们的研究还表明激光热凝固和TURP是部分皮层损伤，类似于II度皮肤烧伤。

成体干细胞已经在很多成体组织中发现，包括表皮干细胞［2］、间充质干细胞［3］、造血干细胞［4］等。同样，目前的研究也表明前列腺部也可能存在着成体干细胞，它的位置可能位于前列腺基底细胞层，并且可能与良性前列腺增生和前列腺腺癌的发生发展相关［5－6］。前列腺成体干细胞有可能参与前列腺切除术后尿道修复的过程。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年未去势雄性家犬30只，年龄大小约6岁，体重18～22kg，遵义医学院本部校区实验动物场提供。

1.2 设备 德国产的Revolix 2μm连续波医用激光手术治疗系统，功率120W，通过550微米的光纤传输能量。24F 12°激光电切镜（德国Wolf公司）。灌洗液为无菌等渗平衡液。

1.3 建立前列腺切除术后模型 家犬10%水合氯醛（0.3ml/100g）腹腔注射麻醉后仰卧位固定于手术台上，下腹部正中切口暴露膀胱。于膀胱前壁预置一荷包缝合线，在荷包缝合中央切开膀胱壁，插入激光电切镜，然后收紧荷包缝合线。以生理盐水作为冲洗液，直视下电切镜由尿道内口进入前列腺部尿道，手术方式模拟体内汽化切除术，持续移动光纤，完成弧形汽化切除，精确切割时将光纤头埋于前列腺组织中，潜行切割，深约1～2mm，切除前列腺部全部尿路上皮和大部分前列腺组织，避免损伤前列腺包膜。术毕缝合膀胱，关闭腹腔。术后均不留置导尿管。

1.4 方法 术后3天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、8周和12周电切镜观察并序贯取材，完成前列腺部尿路上皮 HE染色，观测尿路上皮病理变化和分子标记（UPS、PSA、CD34和CD133）的表达变化。

2 结果

2.1 术后前列腺部尿路上皮修复过程 创面从苍白逐渐变红润，渗血逐渐停止，血块逐渐消失，大量苍白坏死组织覆盖在术后创面上并突向尿道腔，随着修复的进行逐渐脱落，创面逐渐覆盖正常尿路上皮，创面和正常尿路上皮由分界明显变为分界模糊，未见前列腺部远端正常尿道或膀

胱颈口正常尿路上皮向创面爬行生长。

2.2 前列腺部尿路上皮细胞组织形态学变化 术后创面尿路上皮缺损，无新生上皮细胞形成，有凝固性坏死组织附在创面上，创面周围分布有大量炎性细胞 （中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞），离创面越近炎性细胞越密集，随着修复的进行，炎性细胞逐渐减少，创面上逐渐出现新生上皮细胞，由点状逐渐连成片状，进而覆盖整个创面，并逐渐增厚、出现极性，能表达尿路上皮特殊的蛋白。

2.3 前列腺部尿道免疫组化结果

2.3.1 P63在正常尿路上皮的表达 P63是核蛋白，阳性染色区在尿路上皮的细胞核，阳性代表细胞是上皮来源。正常前列腺部尿路上皮连续的基底细胞细胞核被染成黄褐色。

2.3.2 P63在前列腺切除术后尿路上皮的表达 术后3天未见前列腺切除术后的尿道创面出现表达P63阳性的细胞；术后1周见术后创面出现新生的表达P63阳性的细胞，呈岛状分布；术后2周术后创面新生的表达P63阳性的细胞呈线性覆盖整个创面，和周围正常的尿路上皮相连续；术后3周至12周表达P63阳性的基底细胞都成线性覆盖在创面上并逐渐成熟。

2.3.3 CK34在正常尿路上皮的表达 CK34是一组高分子细胞角蛋白，在前列腺基底细胞质中表达，而在分泌上皮细胞不表达。

2.3.4 CK34在前列腺切除术后尿路上皮的表达 术后3天未见前列腺切除术后的尿道创面出现表达CK34阳性的细胞；术后1周见术后创面出现新生的表达CK34阳性的细胞，呈岛状分布；术后2周术后创面新生的表达CK34阳性的细胞呈线，覆盖整个创面，和周围正常的尿路上皮相连续；术后3周至12周表达CK34阳性的基底细胞都成线性覆盖在创面上并逐渐成熟。

2.3.5 PSA在正常尿道的表达 PSA是前列腺腔面腺管上皮细胞分泌的胞质蛋白，在前列腺腺泡、腺管上皮胞质表达，在尿路上皮中不表达。

2.3.6 PSA在前列腺切除术后尿路上皮的表达 术后创面新生的尿路上皮中均不表达PSA。

2.3.7 UPS在正常尿路上皮的表达 尿斑蛋白是尿路上皮最显著的结构，是它的标志蛋白，它们覆盖大约80%的尿路上皮腔面，另外尿路上皮细胞浆的膜泡也含有大量的这种斑块样膜结构，在尿路上皮的细胞浆中表达。

2.3.8 UPS在前列腺切除术后尿路上皮的表达 术后3天未见前列腺切除术后的尿道创面出现表达UPS阳性的细胞；术后1周见术后创面出现新生的表达UPS阳性的细胞，呈岛状分布，厚度约1～2层细胞；术后2周术后创面新生的表达UPS阳性的细胞厚度继续增加，覆盖整个创面，和周围正常的尿路上皮相连续；术后3周至12周表达UPS阳性细胞逐渐成熟并出现极性，且接近尿道腔面的细胞表达较强。

3 讨论

3.1 前列腺部尿路上皮修复过程 激光热凝固是部分皮层损伤，类似于II度皮肤烧伤［7］，我们在实验中也观察到尿路上皮修复过程也类似皮肤烧伤过程分为三个阶段，即炎症反应期、组织形成期、基质重建期，这三个阶段在时间和空间上相互重叠［8，9］。

前列腺部尿路上皮再上皮化过程：

术后3天：创面上未见新生尿路上皮。

术后1周：岛状新生上皮细胞形成，1～2层。

术后2周：新生尿路上皮完全覆盖创面，大多数新生上皮欠均匀，厚度4－6层，缺乏极性。

术后3周：新生上皮厚度较均匀，为6～8层，细胞初具极性，细胞体积增大。

术后4周：新生上皮厚度较均匀，为6～8层，细胞极性较前更加显著，细胞体积增大。

术后6周：新生上皮厚度较均匀，为6～8层，细胞极性较前更加显著，细胞体积增大。

术后8周：新生上皮厚度均匀，多为6～10层，细胞极性明显，但细胞体积仍较大。

术后12周：新生上皮厚度均匀，多为6～10层，细胞极性明显，细胞正常。

3.2 前列腺部尿路上皮修复机制的探索 从前列腺切除术后尿道再上皮化的过程中可以看出上皮从残存的前列腺再生并分化为尿路上皮的可能性较大。尿路上皮最靠近尿道腔面的一层细胞是伞状细胞，最显著结构特点是其特异的表面膜结构，被称为尿斑蛋白，这些尿斑蛋白在维持伞细胞功能上起着重要作用，是尿路上皮细胞分化的标志蛋白［10］。尿路上皮的各层细胞逐渐出现并极化，经过约12周的时间恢复正常并在再上皮化的过程中逐渐分化出特异性的尿斑蛋白。所以，前列腺切除术后前列腺部创面的尿路上皮再生修复可能来源于手术未切除的前列腺组织。

3.2.1 前列腺组织细胞是前列腺部尿路上皮再生的细胞来源之一 前列腺切除术后3天在创面上未见表达尿斑蛋白阳性的细胞；术后1周后残余的前列腺组织接近创面的腺泡状细胞和创面新生的细胞均表达尿斑蛋白阳性，创面新生的细胞呈岛状分布，约1～2层；随着进一步修复，新生尿路上皮细胞层逐渐增厚，并出现明显的极性，且表达尿斑蛋白阳性最强的细胞总是位于接近尿道腔面的细胞层。所以我们推测新生的尿路上皮可能来源于残余的前列腺组织细胞。

3.2.2 前列腺相关干细胞可能是术后前列腺部尿路上皮再生的细胞来源之一 人们已经在个体生长发育的各个阶段以及多个成体组织中发现干细胞，前列腺组织也可能存在发挥重要作用的干细胞。通过对鼠的研究发现位于前列腺导管的近端存在着一种具有干细胞特征的细胞群［11－12］，以及Lin VK［13］发现前列腺基质部有一种具有自我更新能力的、来源于良性前列腺增生组织的前列腺基质细胞亚群。

干细胞具有强大的增值分化能力，Taylor RA［14］等建立了上皮细胞和人类胚胎干细胞相互作用的模型，培养出了人类前列腺组织，在第8～12周时它就能表达前列腺特异性抗原。其后，Leong KG［15］等从成年老鼠前列腺中分离出具有多项分化潜能、能自我更新的细胞，移植入体内后能分化增殖为具有分泌功能的前列腺。

在实验中我们使用了具有特异性标记物来观察前列腺细胞参与尿道修复的过程，其中包括P63、CK34、CD133？：

①P63：p63是核蛋白，P63基因被认为是P53基因家族的新成员［16］。它在尿路上皮细胞等均有表达［17］。SIGNORETI等［18］较早发现P63在前列腺发育过程中起重要作用，并证实其在前列腺基底细胞中表达。P63缺如的鼠上皮会有各种各样的缺陷［19－21］。P63阳性染色区在尿路上皮的细胞核。实验中发现残余的前列腺腺泡基底细胞就参与尿路上皮的再生过程，新生的尿路上皮细胞从一开始就表达P63阳性，这提示残余的前列腺组织中的腺泡基底细胞可能参与前列腺部尿路上皮的再生修复过程；②CK34：细胞角蛋白是细胞骨架蛋白的一种。CK34是前列腺基底细胞的一种特异性标记物［22］，CK34蛋白为胞浆着色，在显微镜下观察较P63更加直观，实验中发现CK34和P63的表达呈现出类似的表达规律；③CD133：它是一个五次跨膜糖蛋白，其生物学功能尚不十分清楚。在生物体液中 （如神经管液、尿液、唾液等），与CD133相关的膜颗粒随微绒毛的退化及胚胎神经上皮细胞多形突起物的形成而脱落，说明CD133维持干细胞特性。CD133是间质干细胞的阳性标记物［23］，同样是造血干细胞标志物，可能是某些肿瘤的肿瘤干细胞标志［24］。CD133阳性染色区在基底细胞胞质、胞核，腺体细胞的胞质。在实验中发现增生的前列腺腺泡细胞和再生的尿路上皮均表达CD133，它不能直接提示前列腺干细胞参与尿路上皮的修复。

关于前列腺相关干细胞参与尿路上皮的再生，我们可以假设在正常情况下，由于尿路上皮具有的通透屏障作用，这些具有前列腺干细胞特征的细胞在前列腺切除后暴露在和之前不同的外环境下，如直接接触尿液、炎症刺激。在这些因素的刺激下前列腺干细胞从它处于相对静止的状态转入活跃的状态，开始在特定的调控机制下分化增殖，在体内特殊的外环境下向尿路上皮分化增殖，尿路上皮各层细胞逐渐增殖、成熟，最后在形态和功能上都和正常的尿路上皮一样。

4 结论

前列腺切除术后创面附近正常的尿路上皮爬行生长覆盖创面的可能性小，尿液中脱落的尿路上皮细胞是否参与尿路上皮的修复目前尚不能证实，而再生的尿路上皮主要来源于前列腺残余组织，而在前列腺组织中存在的前列腺干细胞可能是这一修复过程的主要参与细胞，目前尚无发现前列腺干细胞的相关证据，但前列腺部具有干细胞相关功能的细胞是否为前列腺干细胞，能否分离后纯化在体外特殊的环境下分化出尿路上皮，注射到前列腺切除术后创面能否加快新生尿路上皮的再生，以及前列腺干细胞需要怎样的增殖分化条件，我们都将进一步探讨。

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The Discussion of Urethral Repair Mechanism after Prostatectom y

TANG Xiao－hu，Luo Guang－heng
1.Zunyi Medical College，Zunyi563003，China；2.Guizhou Provincial People's Hospital，Guiyang 550002，China

Objective：Discuss the source，process，mechanism of urethra prostate epithelial regeneration，and whether prostate stem cells participate in the repair process.Methods：Establish the model of2 micron dogs’prostatectomy，after3 days，1 week，2 weeks，3 weeks，5 weeks，6 weeks，4 weeks，8 weeks and 12 weeks observed prostate urinary epithelial repair process under cystoscope，take biopsy specimen in the wound site，adopt HE staining and immunohistochem（PSA，CK34，P63，CD133 and UPS），observed urinary epithelial repair process under the microscope.Results：Under cystoscope and microscope，do not found normal urinary tract epithelium around the wound crawl to the wound after prostatectomy，and urinary tract epithelial regeneration cells mainly comes from prostate cells.Regeneration of the epithelium of the urinary tract as repair to express UPS，P63，CK34，CD133，but do not express the PSA.Conclusion：After the prostatectomy，it’s impossible of prostate urethra epithelial regeneration come from the normal urinary tract epithelium around the wound，the vital source of cells for urinary tract epithelial regeneration may be prostate cells，and prostate stem cells may participate in the repair process.

urothelium；re－epithelization；prostatic hyperplasia；Stem Cell

R697＋.3

A

1007－8517（2013）12－0056－03

2013.03.28）