PTEN p53及hTERT在Ⅰ型子宫内膜癌中的表达

张桂香，李春辉，齐洁敏，申兴斌，庄新荣，冯振波

(承德医学院附属医院妇科，河北 承德 067000)

子宫内膜癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，近年来发病呈上升趋势。在其发病过程中抑癌基因的失活、突变和癌基因的异常激活发挥着重要的作用，基因的表达产物为蛋白。本研究应用免疫组化法同步检测子宫内膜癌中PTEN、p53、hTERT三种蛋白的表达，旨在探讨三者在子宫内膜癌发生发展中的作用，为子宫内膜癌的早期诊断、判断预后以及靶向治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料:选择2011年1月至2012年12月经病理结果证实Ⅰ型为子宫内膜癌而入住我院接受手术治疗的患者49例为研究对象，各患者术前均无放化疗病史，年龄41－69(53.4±3.6)岁。子宫内膜样癌 G1期12例、G2期27例、G3期10例。子宫内膜癌手术－病理分期 (按2009年FIGO标准):Ⅰ期34例(ⅠA期15，ⅠB期19例)、Ⅱ期10例，Ⅲ期4例，Ⅳ期1例。取同时间段因子宫肌瘤行子宫切除术的正常子宫内膜49例做对照。

1.2 试剂与免疫组化方法:PTEN鼠抗人单克隆抗体购自北京中山生物技术有限公司，hTERT兔抗人多克隆抗体及p53鼠抗人单克隆抗体购于福州迈新生物工程公司。免疫组织化学操作步骤如下:石蜡包埋组织连续切片4μm贴附于经多聚赖氨酸处理的玻片上，80℃烘烤50min;石蜡切片经二甲苯脱蜡及100%、95%、90%、80%的梯度酒精脱水;3%H2O2孵育10min(室温)封闭灭活内源性过氧化酶;PBS冲洗5min，把切片放入0.01moL/L(pH6.0)枸橼酸盐缓冲液进行微波炉抗原修复10min;加正常山羊血清工作液进行封闭，在37℃湿盒中温育60min;滴加1∶100浓度一抗，37℃湿盒中温育60min后，在湿盒中4℃过夜;PBS洗3×5min，滴加二抗，室温孵育15min，再次PBS洗3×5min;取1mL蒸馏水加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，室温显色;蒸馏水冲洗终止显色，苏木素复染，封片，观察。以PBS替代一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作为阳性对照。

1.3 免疫组织化结果判断:(×400)镜下观察，依据染色强度和阳性细胞所占比例进行综合判定。其中染色强度分级:无着色为0分，淡黄为1分，黄或深黄2分，褐或棕黄3分。阳性细胞所占比例判定:阳性细胞计数＜10%为0分，10% －25%为1分，26% －50%为2分，51% －75%为3分，＞75%为4分;两者相加＜2分为阴性(－)，2－3分阳性(+)，4－5分中等阳性(++)，6－7分强阳性(+++)。结果判定由两名病理科主任医师经双盲法独立评分。

1.4 统计学处理:数据采用SPSS13.0软件处理，计数资料进行X2检验，等级资料进行秩和检验。

2 结果

2.1 PTEN、p53、hTERT在Ⅰ型子宫内膜癌织中的表达:PTEN阳性表达定位于胞质，而hTERT、p53定位于细胞核。表达结果如表1所示。子宫内膜癌组PTEN阳性率为40.8%，且以弱阳性为主，无强阳性表达;而正常子宫内膜组表达强度以阳性及强阳性为主，总阳性率97.9%，差异具有统计学意义(P＜0.01)。p53在子宫内膜癌组有19例(38.8%19/49)为阳性表达，而正常子宫内膜组仅1例(2.0%1/49)为阳性表达，且为弱阳性，二者表达差异具有统计学意义(P＜0.01)。hTERT在子宫内膜癌组阳性率为67.3%，而正常子宫内膜组无表达，差异具有统计学意义(P＜0.01)。

表1 PTEN、p53、hTERT在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达

2.2 PTEN、p53、hTERT三者与子宫内膜癌病理特征的关系:PTEN的阳性表达与子宫内膜癌的组织分级、FIGO分期(2009年)、淋巴转移、肌层浸润深度呈负相关，即恶性程度越高、期别越晚，其表达越低。相反，p53、hTERT与子宫内膜癌恶性程度、FIGO分期呈正相关。差异均有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表2 PTEN、p53、hTERT阳性表达与子宫内膜癌病理特征的关系

3 讨 论

磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homo-Log PTEN)，是迄今发现的第一个具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因［1］，也是人类肿瘤中最易发生突变的肿瘤抑制基因［2］，于1997年首次被报道之后即成为研究热点，是继p53基因后另一个较为广泛地与肿瘤发生关系密切的基因。其表达产物PTEN蛋白作为一种肿瘤抑制因子，通过阻止细胞生长和分裂的速度调控细胞分裂周期及细胞凋亡，因此PTEN蛋白一旦缺失，细胞则可发生异常增生甚至恶性变。另外，PTEN蛋白具有协助控制细胞转移、细胞与周围组织的粘附和血管发生的功能，因而与肿瘤的转移扩散相关。据报道PTEN基因缺失率在子宫内膜癌中最高，32% －55%不等，故被视为子宫内膜的“看家基因”［3］。本研究发现PTEN蛋白在正常子宫内膜组阳性表达率为97.9%，而子宫内膜癌中仅为40.8%，下降了57.1%，非常接近国外报道的基因缺失率最高值;其阳性表达与子宫内膜癌的组织分级、FIGO分期(2009年)、淋巴转移、肌层浸润深度呈负相关，换言之，随着肿瘤恶性程度升高及进展，其表达进一步降低。这一结果说明PTEN蛋白的减少与子宫内膜的发生发展相关。

p53是一种抑癌基因，但极易发生突变，故分为野生型和突变型两种。其中野生型p53基因是一种抗癌基因，其表达的p53蛋白的半衰期很短，用免疫组化方法不易检出。而突变型p53基因失去了修复DNA和诱导细胞凋亡的能力，致使细胞过度增殖、凋亡减少以及细胞转化，促进恶性肿瘤的发生和发展［4，5］。其表达的突变型p53蛋白的半衰期延长，稳定性高，在细胞核内积聚，可用免疫组化方法检测到。以此推断本研究所测出的p53蛋白为突变型。本研究结果显示在正常子宫内膜组变异型p53蛋白仅1例(2.0%)表达为弱阳性，子宫内膜癌组阳性表达率升高至38.8%(19/49)，并与子宫内膜癌的组织分级、FIGO分期(2009年)、淋巴转移呈正相关，这一结果与上述理论基础相符。但用同一理论则无法解释突变型p53蛋白与肌层浸润深度无关的实验结果，这可能与样本较小有关，也可能与突变型p53蛋白在子宫内膜癌发展中的作用机制有关，有待进一步研究证实。

人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)被认为是端粒酶的催化亚单位，是端粒酶活性表达的关键组分和限速因子［6］。而端粒酶的激活是细胞获得永生化和(或)恶性变的重要机制。因此hTERT对细胞增殖、衰老、永生化及癌变起重要作用。本研究结果显示正常子宫内膜组无hTERT表达，而子宫内膜组阳性表达率为67.3%，且42.9%为一般阳性及强阳性表达。其阳性表达率与子宫内膜癌的组织分级、FIGO分期(2009年)、淋巴转移、肌层浸润均呈正相关(P＜0.05)。然而国外研究表明hTERT在子宫内膜癌组织中阳性表达与子宫内膜癌的组织分级相关，与FIGO分期无关［7］。也有研究显示子宫内膜癌组织hTERT强阳性表达率为80%－90%，且与子宫内膜癌肌层浸润及临床分期呈正相关。虽然各家的报道不尽相同，但hTERT在子宫内膜癌中高阳性表达率以及与组织分级呈正相关的观点基本一致，这表明hTERT可作为子宫内膜诊断及判定预后不良的标记物应用于临床。与正常子宫内膜相比，PTEN在子宫内膜癌中表达减少，而p53及hTERT呈表达升高，三者均可作为子宫内膜诊断及判定预后的标记物。

［1］Erkanli S，Kayaselcuk F，Kuscu E，et al.Expression of survivin，PTEN and p27 in normal，hyperplastic，and carcinomatous endome －2 trium［J］.Int Gynecol Cancer，2006，16(3):1412 －1418.

［2］Mirantes C，Eritja N，Dosil MA，et al.An inducible knock－out mouse to model cell－autonomous role of PTEN in initiating endometrial，prostate and thyroid neoplasias［J］.Dis Model Mech，2013，2:8.

［3］Li L，Ross AH.Why is PTEN an important tumor suppressor［J］.Cell Biochem，2007，102(6):1368 －1374.

［4］迟元卫，陈健，刘亮等.结肠癌中hTERT和p53蛋白表达及临床意义［J］.山东大学学报(医学版)，2011，49(4):115 －117.

［5］Takeda T，Dong X，Take da H，et al.Successful immune therapy combined with hyperthermia therapy for cancer patients［J］.Gan To KagaKu Ryoho，2006，33(12):1739 －1741.

［6］Blackburn E H.Telomere states and cell fates［J］.Nature，2000，408(6080):53－56.

［7］Brustmann H.Immunohistochemical detection of human telomerase reverse transcriptase(hTERT)，topoisomerase IIalpha expression，and apoptosis in endometrial adenocarcinoma and atypical hyperplasia［J］.Int Gynecol Pathol，200，24(2):184 －192.