仔猪流行性腹泻流行现状及免疫探究

徐国栋

（天津市动物疫病预防控制中心，天津宜兴埠北 300402）

近10年来,全球的哺乳仔猪不时承受着不明致病因子所致腹泻的危害，此类腹泻症候群被称为新生仔猪腹泻，兽医工作者仍在为寻找最可能的病原进行着努力，近来，Per Wallgren等[1-2]（瑞典）认为大肠杆菌并非此类疾病的致病因子，真正的病原可能是某种病毒，并宣布已经找到了一个可能的致病因子。H Kongsted等[3]（丹麦）同样认为产肠毒大肠杆菌（ETEC）、C-型产气梭菌、轮状病毒（PRoV）都不是该症候群的主要致病原。HT Hoang等[4]（韩国）则认为美国养猪业的新生仔猪PRoV 相关肠炎尤为重要，2011年爱荷华州立大学兽医实验室使用RT-PCR 方法对2461例猪腹泻病例粪便或肠道内容物进行PRoV A、B、C（依轮状病毒VP6抗原性不同可划分7个已知血清型，A、B、C、E4个血清型与猪腹泻有关）血清型调查，结果33.9%样品呈阳性，通过溯源分析发现C 型PRoV 常见于新生猪腹泻、A 型PRoV 是断奶后仔猪腹泻的主要原因。同年，T Opriessnig等[5]（美国）发表了依阿华州立大学兽医实验室基于对88份有腹泻史病猪的粪便样品（源于哺乳仔猪13份、源于39个、源于不确定日龄19个）检测的结果，发现检出率较高的病原依次是星状病毒4 型（阳性率53.4%）、猪细环病毒2 型（阳性率48.9%）、猪细环病毒1 型（阳性率31.8%），并推测前两种病原很可能在生长育肥猪群广泛流行。

在亚洲地区，最让养猪业者关注的是猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea Virus，PEDV）所致哺乳仔猪的流行性腹泻（porcine epidemic diarrhea，PED）[6-10]。

在国内，尽管发现导致新生仔猪腹泻的病因很多，但2010年至2012年，多数学者从表现有呕吐、水样腹泻、迅速脱水、高死亡率为特征的新生仔猪样品中分离到PEDV。可以认为：PEDV 是近三年来引起新生仔猪腹泻最重要病原[11-22]。在此，笔者就近三年来国内PED 的流行情况综述如下：

1 国内猪群感染现状

陈强等[11]在2009年3～6月间对福建省16个规模化猪场的6～60日龄腹泻仔猪粪便进行致病性大肠杆菌（EPEC）、流行性腹泻病毒（TGEV）、PEDV、PRoV 的检测（PCR 或RTPCR ），结果1个猪场EPEC阳性（场阳性率6.25%）；1个猪场TGEV阳性（场阳性率6.25%；TGEV：猪传染性胃肠炎病毒）；3个猪场PEDV阳性（场阳性率18.75%）；3个猪场PRoV阳性（场阳性率18.75%）；1个猪场EPEC和PEDV 两种病原因子同时呈阳性。张志等[12]在2010年～2011年上半年间所采集的腹泻猪粪便样品中检测到PEDV 变异株，且与2011年韩国流行株的同源性最高，针对部分猪场流行病学追溯发现，尽管多数猪场均免疫过TGE－PED二联苗，但部分仔猪发病率仍高达90%，死亡率50%以上。Wentao Li等[13]在2011年1～10月间，从国内12个省、57个猪场共采集到455份样品，检测（RT-PCR）到PEDV阳性场45个（场阳性率78.95%），检出PEDV阳性样品278份（样品阳性率为61.10%）。陈建飞等[14]对2011年3月份后采集的11个省（市）28个猪场共计139份哺乳仔猪腹泻样品（粪便或小肠内容物）进行了检测（免疫胶体金、RTPCR），检出含PEDV 样品76份（样品阳性率54.7%），检出含TGEV 的样品53份（样品阳性率38.1%），检出同时含PEDV和TGEV 的样品36份（样品阳性率25.9%），检出含猪PoRV 的样品7份（样品阳性率为5.04% ），检出含猪嵴病毒（kobuvirus）的样品2份（样品阳性率为1.44%），由此认为近来国内新生仔猪腹泻病的主要病原为PEDV，其次为TGEV。G wang等[15]在2011年间收集到国内主要养猪省份48个猪场、756份腹泻仔猪的小肠样品，检测（RTPCR）结果PEDV阳性场26个（场阳性 率54%）；PEDV阳性样品278份（样品阳性率54.6%）。刘孝珍等[16]对2011年间自国内10个省2个直辖市（福建、广东、广西、河南、河北、山东、吉林、黑龙江、新疆、浙江、北京、上海）、共计55个严重腹泻场采集到的219份仔猪小肠和粪便样品进行检测（免疫胶体金、RT-PCR），结果单独感染PEDV 的场9个（场阳性率16.36%）；同时检出TGEV和PoRV 的场29个（场阳性率52.73%）；单独检出PEDV 的病料73份（样品阳性率33.33%），同时检出TGEV和PoRV 的 病料61份（样品阳性率27.85%），汇总显示腹泻场猪群存在PEDV 感染占69.09%，病料中可检测到PEDV 的占61.19%。张志等[17]对2011年间采自河南省和辽宁省2个规模猪场的2～7日龄水样腹泻仔猪的粪便样品进行了PEDV、TEGV和PRoV 检测(巢式RT-PCR)，检出PEDV阳性样品43份（样品阳性率100%），未检测到TEGV和PRoV阳性样品。所检测到的多株PEDV，经过基因测序分析和动物试验，显示2011年流行的PEDV 毒株为新流行株。甘海霞等[18]对2011年间自广西34个县、144个猪场采集的216份腹泻粪便样品进行了检测（RT-PCR），检出PEDV阳性样品60份（样品阳性率27.78%），检出TGEV阳性样品16份（样品阳性率7.41%），认为广西境内猪群腹泻病原主要为PEDV，哺乳仔猪发病率和病死率较高。徐国栋等[19]在2011年未对流行于天津地区的哺乳仔猪腹泻进行了以TEGV、PEDV、PRoV、PRV（伪狂犬病病毒）、CSFV（猪瘟病毒）、PRRSV（蓝耳病毒病毒）、霉菌毒素中毒为主要致病因子的调查，最终认为PEDV是致哺乳仔猪腹泻的主要病原。Fei-Fei Ge等[20]对2011年9月～2012年1月间自上海26个猪场采集的猪肠道和粪便样本135个（其中18个猪场的95 头猪在有腹泻疾病时取样，其他样品采自无临床症状的猪）进行了病原的检测。结果发现样品PEDV阳性率为26.3%，TGEV阳性率为3.1%，PRoV阳性率为8.4%，PRV阳性率为35.8%，胞内劳森氏菌阳性率4.2%，但是健康猪群的PEDV、PRV阳性率分别为0%、92.5%。由此认为PEDV和PRV 两种病原在猪腹泻中发挥重要作用，而由PEDV阳性率与腹泻的相似性推断PEDV 是2010年底引起上海地区猪腹泻的主要因素。肖博仁[21]对2011年8月～2012年3月间自湖南省9个地区、13个养殖场采集到的60 头腹泻仔猪肠道及其内容物样品进行了检测（RT－PCR），结果PEDV阳性场9个（场阳性率69.2%），PEDV阳性仔猪39 头（样品阳性率为65%）。秦谷雨等[22]对2011年10月～2012年5月间自安徽37个规模化猪场收集到的腹泻仔猪粪便或病死猪肠段共计186份进行了PEDV、TGEV、PRoV、PRV、PCV－Ⅱ（猪圆环病毒Ⅱ型）五种病原的检测，发现PEDV阳性场28个（场阳性率75.7%）、病料阳性数110份（样品阳性率59.1%）；TGEV阳性场占3个（场阳性率8.1%）、病料阳性数10个（样品阳性率占5.4%）；PRoV阳性场1个（场阳性率2.7%）、病料阳性数5份（样品阳性率2.7%）；PRV阳性场8个（场阳性率21.6%）、病料阳性数15份（样品阳性率8.1%）；PCV－Ⅱ阳性场20个（场阳性率54.1%）、病料阳性数48份（样品阳性率25.8%）；同时，PEDV和TGEV 混合感染占4.3%，PEDV和 PCV－Ⅱ混合感染占18.8%，PEDV和与PRV 混合感染占10.8%，PRV和PCV－Ⅱ混合感染占4.8%；其他病因50例，占26.9%。由此推断PEDV、PCV－Ⅱ、PRV的单纯或混合性感染是近来安徽境内致仔猪腹泻最重要的三种病原。2012年，华南农业大学从国内南部6 省（广东、广西、江西、四川、福建、江苏）、48个养殖场所共收集的127份腹泻粪便中均检测到PEDV阳性样品55份（样品阳性率43.0%）[23]。

综上所述，从以上研究者采集病料所分布的区域看，近三年来可检测到PEDV 的仔猪群几乎分布于全国范围：福建、湖南、广东、广西、江苏、安徽、浙江、江西、四川、山东、河南、河北、黑龙江、辽宁、吉林、北京、上海、天津、新疆，并且其它省份也有相关报道，如甘肃[24]、重庆[25]等，由此推断，当前国内养殖形势下，几乎不能找到无PEDV 感染猪群存在的省（市）。若对以上可查阅到的2010年后PEDV 文献资料中所载有关数据进行阳性场、抽样阳性份数的粗略汇总，汇总时因陈建飞的文献数据与刘孝珍的文献数据可能重复，则选择刘孝珍的数据，甘海霞和Fei-Fei Ge 资料中的“阳性场数/总场数”不可计算，则可对得到的7组场、9组样品数据进行统计，结果是：场阳性率68.29%、样品阳性率47.02%，因研究者的采样多数源于腹泻症状的猪场，所统计阳性率可能偏高于全国实情，但与以往报道相比，近三年来哺乳仔猪中PEDV 的检出率仍略高于2010年前[11、19]，事实上，国内多数养猪业者在近三年来感觉到：不知何种诱因导致哺乳仔猪发生PED 时的症状明显加剧了。2012年11月13日，农业部印发了 《生猪腹泻疫病防控技术指导意见（试行）》（农医发〔2012〕23号）[26]，要求各级畜牧兽医部门加强对生猪腹泻疫病进行针对性防治和综合防疫管理，其中包括使用国家批准使用的PED～TGE 二联灭活疫苗免疫妊娠母猪。

2 国内分子流行病学调查情况

做为单股正链RNA 冠状病毒的PEDV，在复制过程中，因缺乏校对功能（而DNA 病毒复制过程中DNA 聚合酶具有这一功能）致错配率为10－3～10－4/nt，基因组越长则丢失遗传信息的机率越高。因这类病毒mRNA 为不连续转录，未完成mRNA 合成的mRNA 中间体可随时从模板上脱落，脱落中间体具有与其它毒株的RNA模板重新结合的可能性，最终造成复制过程中的碱基突变[27-28]。Wentao Li等[13]对2011年1月到10月间所收集样品中PEDV 的S 基因（纤突糖蛋白基因）分析发现：国内PEDV 经典毒株和变异毒株在同时流行，部分毒株与韩国弱毒株DR14 同源性较高，高死亡率猪场有变异PEDV 毒株的流行，这些变异株PEDV 基因组存在氨基酸的插入和点突变，传统弱毒疫苗不能对猪群感染PEDV 变异毒株提供免疫保护，在攻毒实验中，变异毒株导致仔猪100%死亡。张志等[17]对2011年下半年收集的43份腹泻样品PEDV 的M 基因（膜糖蛋白基因）进行测序和分析，发现分离株均属于基因G2.3 亚型，同源性为99.2%～100%，与2008年泰国和2011年2韩国和流株属同于一个进化分支，实验证明具强致病性。G wang等[15]对2011年间国内不同地区收集的6个PEDV 野毒进行M 基因和ORF3 基因（ORF3 蛋白基因，为PEDV 唯一辅助基因、与毒力有关）分子演化距离推测，发现一些分离株已形成不同的新分支，国内流行的PEDV 具有很强的突变和重组潜力，认为病毒主要囊膜蛋白基因发生了相当大的变异，但分离株保有了很强的致病性。刘孝珍等[16]对2011年间所分离27 株PEDV 的S 基因、N 基因、ORF3 基因进行了分析：分离株S 基因核苷酸序列同源性为93.6%～99.9%，与其它参考株同源性为92.8%～100%，存在点突变、插入、缺失、重组现象，但包括参考株在内所有S 蛋白抗原表位没有明显差异。所构建的S 基因系统进化树显示所分离的17个毒株属于Ⅰ群的第1-1 亚群（该亚群还包括了部分韩国毒株如Knu0903等）、3个毒株属于Ⅱ群的2-1 亚群（该亚群还包括了部分韩国毒株如Knu0801和日本株NK等）、7个毒株属于Ⅱ群的2-2 亚群（该亚群还包括了部分韩国毒株和日本的毒株及经典CV777 毒株等）。对20 株PEDV 分离株N基因核苷酸同源性分析发现其同源性为95.2%～100%，与参考毒株相比存在点突变，未发现缺失和插入，但部分毒株存在重组现象。N 基因系统进化树显示20 株分离株包含于Ⅰ群（其中包括CV777和部分韩国毒株等）中的有11 株、包含于Ⅱ群的只有3 株分离株、包含于Ⅲ群（其中包括了我国以前分离得到的部分毒株如JS-2004-2等）中的有6 株，可以看出N 基因变异仍较保守。对25 株PEDV 分离株ORF3 蛋白基因核苷酸序列分析显示分离株同源性为95.2%～100%，与参考毒株相比，存在点突变，未发现缺失和插入。所构建的系统进化树显示包含于Ⅰ群（该群还包括了中国其它流行株、CV777株等）中的有23 株、没有分离株包含于Ⅱ群中、包含于Ⅲ群（该群还包括了CH/BJ/2001、CH/HLJHH-1/2011、CV777等）中 的 有2 株，多数毒株(23/25) 与Brl/87 株亲缘关系较远，而与韩国（如DR13、Chinju99等）亲缘关系较近，即国内有不同于疫苗株的新基因型PEDV在流行。Fei-Fei Ge等[20]对2011年9月～2012年1月间自上海地区所分离10 株PEDV 的681bp M 基因和675bpORF3 基因进行了分析，发现所有分离株M 基因与Group3 亲缘关系较近，不同于包括疫苗株在内的其它毒株。分离株ORF3 基因与韩国株亲缘关系较近。SH4 株由欧洲野毒株（CV777和Brl/87）进化而来，SH5株由CV777 疫苗株演变进化而来。由此推断上海PEDV 流行株分离株存在遗传多样性。肖博仁[21]对2011年8月～2012年3月湖南地区流行的PEDV 部分S 基因扩增、克隆、测序，发现该地区存在S 基因型的多样性，与国内其它省份流行毒株类似，只是个别分离株发生了点突变。构建的S 基因核苷酸序列系统进化树显示该地区流行株可分两个群：1个群与广州、河南、黑龙江流行毒株相似，而可能是弱毒的株洲株与另一个群中的甘肃毒株和江苏毒株相似。

综上所述，虽然目前认为PEDV只有一个血清型，但基于S 基因、ORF3 基因、M 基因点突变为主的新基因型毒株分支形成可能是导致免疫效果较差的原因，有些毒株存在重组潜力，而部分学者分离到的弱毒株是否来源于疫苗毒仍是个疑问，在此提醒养殖者应根据本场实情慎用弱毒疫苗。笔者认为，除致病微生物的变异因素外，当前国内养猪业者更应考虑以下两点：（1）是否真正执行了生物安全措施对PEDV 的传播进行防范。例如，确实对进出场人员实行了严格的管理、确保对保育箱内的腹泻粪便及时清除和消毒、保证清污用具不会作为机械性传播工具、对场内粪污污染交叉点进行了有效消毒、完全预料到了“返饲”攻毒可能的长久性后遗效应等。（2）是否考虑过猪群免疫系统功能紊乱或低下可能是PED 在某些猪场长期循环式流行的重要原因。笔者在临床中观察到有时使用含本场PEDV 的病料返饲母猪群，被攻毒猪群或表现明显的呕吐、腹泻症状，或根本就无任何症状出现，但仍不能在短期（如1～2个月内）内为所生产的哺乳仔猪提供强有力的被动保护。在感染母猪群，有的个体反复出现软便、稀便的症状，其后代仔猪腹泻的机率很高。

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