补肾活血对人脐静脉内皮原代细胞NO表达的影响1）

刘中勇，李 林，方 家，陈宁南，邓 鹏，方险峰，邹国辉

中医学认为妇女在绝经后机体开始向老年过渡。此时肾气渐衰、天癸渐竭，女子以血为用，因数脱于血，且精血同源，故绝经后相关疾病以肾阴虚者多见[1，2]。在更年期综合征中医研究中，本病大多被认为属肾阴亏虚[3，4]。中医证型与性激素相关性研究也表明，促卵泡生成激素（FSH）、促黄体生成素（LH）升高，雌二醇（E2）下降，血清中NO水平明显降低均为肾阴虚型[5，6]。肾为先天之本，通过其“藏精化血”，“主骨生髓、髓生血”的功能直接参与气血活动，由于肾与血在生理上关系密切，因此，在病理上近代有关“肾虚血瘀”的论述颇多，认为肾虚必兼血瘀。“肾虚血瘀”也是妇女发生绝经后冠心病（coronary heart disease，CHD）的主要病机[7，8]。应用原代培养的人脐静脉内皮细胞作为载体，加入eNOS抑制剂L－NAME处理细胞，制备NO低表达细胞模型，观察补肾活血方剂对原代细胞NO分泌的提高作用。

1 材料与方法

1.1 材料 标本采自江西中医药大学妇产科正常分娩的新生儿脐带。健康孕妇剖宫产后，无菌条件下剪取脐带20cm，浸泡在磷酸盐缓冲液中。立即对脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行分离培养。

1.2 仪器及试剂 DMEM培养基GIBCO公司，0.25%胰酶（广州杏海生物，Ginbio），Ⅷ抗体（武汉博士德），I型胶原酶（sigma公司），FITC标记荧光二抗（武汉博士德），胎牛血清（杭州四季青），青链霉素双抗（广州杏海生物，Ginbio），NO检测试剂盒（上海碧云天），倒置显微镜（NIKO），荧光显微镜 （Leica），超净工作台（江苏苏净），酶标仪（BIOTEK）。

1.3 样品采集 取剖宫产新生儿脐带，注入NaCl至静脉另一端流出液体透明为止。把37℃预热的0.1%Ⅰ型胶原酶注入脐静脉至下端溶液流出，用止血钳夹闭下端静脉，继续向静脉内注入胶原酶，用另一个止血钳夹闭静脉上端，将脐带放入37℃CO2孵育箱中消15min。消化完毕后，松开脐带两端止血钳，收集静脉冲洗液，1 000r／min离心5min，弃上清。细胞重悬于RMPI1640培养液中，13%胎牛血清，置37℃，5%CO2孵育箱中培养。隔2d～4d更换1次培养基直至长成单层细胞。原代细胞生长融合至80%以上，用0.25%胰酶消化2min，1∶2传代。

1.4 细胞因子Ⅷ免疫荧光染色 以每孔2×104／mL细胞密度接种24孔培养板做细胞爬片，培养24h，PBS洗3次，4%多聚甲醛室温固定15min，－20℃预冷甲醇通透10min，5%羊血清室温封闭1h，加小鼠抗人Ⅷ单抗（空白对照用PBS替代），4℃过夜。PBS洗3×5min，生物素山羊抗小鼠二抗室温反应30 min，PBS洗3×5min。DAPI染色5min，荧光显微镜观察。

1.5 药物处理 补肾活血方：熟地黄20g，山萸12g，山药12 g，泽泻9g，丹皮9g，茯苓9g，丹参15g，水蛭3g。煎煮过滤除菌，低温保存备用。

1.6 含药血清制备 选用日本纯种大白兔二只，其中一只分别每日分2次给予补肾活血方总量15g／kg；另一对照组每日给予等量温开水（15mL），灌胃10d后，于取血前12h、6h、3h、1h再各灌胃1次，并于取血前24h禁食（不禁水），心脏采血，取血后无菌分离血清，经56℃、30min灭活处理后，用0.45μm的微孔滤膜过滤除菌，置－20℃冰箱保存备用。

1.7 浓度血清制备 对照组：将15mL正常兔血清、5mL新生牛血清加入80mLRPMI1640液至100mL；不同浓度含药血清（即20%、10%、5%）：将20mL、10mL、5mL含丹地剂血清分别加入至每瓶有5mL新生牛血清、75mLRPMI1640液中，后两组分别再补充正常兔血清15mL、20mL，使三组总量分别至100mL。

E2组：将17β－雌二醇用 RPMI1640液配成0.01μmol／L。空白组为不含兔血清，单纯为培养液。

取对数生长细胞铺种六孔板，每孔5×105细胞，每组3复孔。加eNOS抑制剂L－NAME按照10－6mol／L加入除空白组外所有组，预孵育1h加入不同剂量含药血清继续培养至24h收集上清液检测NO含量，提取蛋白质做Western blot检测。

1.8 细胞上清液中NO浓度测定 取出Griess ReagentⅠ和Ⅱ，使恢复室温 ，取细胞上清液或者标准品50μL加试剂Ⅰ和试剂Ⅱ各50μL。酶标仪540nm检测吸光度，利用标准曲线计算样品浓度。

1.9 Western blot检测蛋白eNOS蛋白表达 0.01mol／LPBS洗涤细胞两次，每孔加入100μL RIPA裂解液，置冰上裂解20 min后，用干净的细胞刮刷将细胞刮于孔的一侧，然后用移液器将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中，4℃，12 000r／min离心5min，取上清。采用BCA蛋白定量试剂盒检测。剩余样品按比例加入5Xloading buffer，煮沸10min，分装后－20℃保存。每个样品取30μg置于10%SDS－PAGE凝胶上电泳分离，转移至PVDF膜上。室温下用5% 脱脂奶粉封闭1h。eNOS抗体以封闭液按照1∶500的比例稀释，与PVDF膜一起封闭在杂交袋中4℃过夜后，与1∶6 000稀释的羊抗兔IgG，室温孵育1h。用SuperECL Plus超敏发光液按试剂说明要求显影、曝光。用Quantity one分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。目的蛋白的灰度值除以内参GAPDH（1∶1 000）的灰度值以校正误差，所得结果即为样品中eNOS蛋白相对表达量。

1.10 统计学处理 运用SPSS 15.0软件包分析，实验数据以均数±标准差（±s）表示。

2 结 果

2.1 细胞分离 用1%I型胶原酶消化20cm长脐带所收获的内皮细胞，接种于6cm培养皿，密度为105／mL～106／mL。接种4h后细胞开始贴壁，12h后大部分贴壁，24h后即可第一次换液除去未贴壁的红细胞。早期的内皮细胞多呈小多角形、球形、短梭形，细胞单层生长，互不重叠。当原代细胞接种密度达到105／mL～106／mL时，在接种48h～72h生长最旺盛，4d～5 d即可融合。融合后的HUVEC为扁平多角形，呈典型的鹅卵石或铺路石样排列。细胞胞核清晰，细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个。免疫荧光显示，细胞与FITC标记的Ⅷ蛋白结合，在荧光显微镜下呈绿色荧光，表明细胞表达Ⅷ蛋白，DAPI染色细胞核呈蓝色。

2.2 细胞上清液中NO浓度 eNOS抑制剂与药物处理细胞24h后。NC组（只加L－NAME）与空白组比较，NO含量明显减少（5.64μmol／L±0.12μmol／L，P＜0.05）。阳性对照药物雌二醇处理组明显升高NO含量（13.52μmol／L±0.19μmol／L）。药物处理组提高内皮细胞被L－NAME抑制的NO分泌。20%、10%、5%含药血清处理 NO含量分别为（11.51μmol／L±0.68μmol／L，P＜0.05），（10.45μmol／L±0.36μmol／L，P＜0.05），（7.50μmol／L±0.45μmol／L，P＞0.05）。

3 讨 论

正常的内皮功能对于血管壁具有重要的保护作用，血管内皮细胞损伤是动脉粥样硬化及许多疾病的始动环节[9]。内皮细胞损伤后发生的功能改变则是导致心血管疾病（如高血压、心衰、冠心病、术后再狭窄、原发性肺动脉高压等）发生发展的重要因素，同时也参与肾病、糖尿病等一些难治性疾病[10]。血管内皮细胞分泌的NO不仅可以调节血管平滑肌张力，也能抑制血小板聚集、白细胞黏附以及平滑肌细胞增殖，还可以减轻氧自由基造成的血管内皮功能障碍[11]，被认为是一种“内源性的抗动脉粥样硬化分子”[12]。NO是由NOS催化L－精氨酸转化而来，NOS是其生物合成的关键限速酶。NO生成减少是血管内皮功能不全的一个重要特征[13]。以血管内皮细胞功能障碍为共同特点的糖尿病、脑梗死、冠心病及高血压等疾病患者，其血清NO水平明显降低[14]。大量实验证明，雌激素作用于内皮细胞后，一氧化氮合酶（eNOS）的数量上调[15]。雌激素的心血管保护作用与一氧化氮有关。成功分离培养人脐静脉内皮细胞，观察补肾活血方的研究表明，补肾活血方对更年期综合征具有良好效果，对绝经女性血脂构成有正性作用。

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