三七总皂苷对动脉粥样硬化血管内皮的保护作用1）

刘桂林，窦迎春，乔 云

血管内皮细胞（VEC）的损伤与功能障碍在动脉粥样硬化（AS）进展中具有重要的作用。减少内皮细胞损伤，改善和提高血管内皮细胞功能、逆转内皮细胞的功能障碍成为防治AS的一种新思路。三七总皂苷（total panax notoginsenosides，TPNS）是中药三七的主要活性成分。临床TPNS及其制剂广泛应用于AS、高脂血症及冠状动脉粥样硬化性心脏病等血管性疾病的治疗中，具有良好的调脂、抗氧化、抗血小板聚集作用[1]。TPNS可降低氧化型低密度脂蛋白（oxLDL）诱导的人脐静脉内皮细胞细胞分化抗原40（CD40）、血管细胞黏附分子－1（VCAM－1）的基因及蛋白表达水平[2]。本研究采用体内研究方法，观察了TPNS对动脉粥样硬化小鼠血管内皮的保护作用，分析其可能机制，进一步阐明抗动脉粥样硬化的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物与药物 8周龄雄性载脂蛋白E基因敲除（apoE－KO）小鼠24只，同种属C57BL／6J小鼠8只，SPF级，均购自北京大学医学部实验动物中心，动物许可证SCXK（京）2006－0008。TPNS粉末购自山东省药品检验所。辛伐他汀片（舒降之，杭州默沙东制药生产，批号H10970385）。

1.1.2 仪器与试剂 紫外分光光度仪（Beckman counter DU800，America）；酶标仪（DV800，Bechman，America）；全自动生化分析仪（Hitachi 917Roche Diagnostics，Germany）；Tgradient96型 PCR热循环仪（Whatman Biometra，Germany）；Light－Cycler型荧光实时定量PCR系统（Roche Diagnostics，Germany）。主要试剂：氧化修饰的低密度脂蛋白ELISA测定试剂盒（E0527m）；Trizol、Oligo dT和dNTP购自Invitrogen公司；MMLV购自Promega公司；荧光实时定量PCR试剂盒购自Takara公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及给药 apoE－KO 小鼠给予高脂饮食喂养（15%脂肪，0.25%胆固醇，84.75%的基础饲料）。12周后，随机分为模型组、三七总皂苷组、辛伐他汀组，每组8只。三七总皂苷组给予TPNS 60mg／kg灌胃，1次／日；辛伐他汀组给予辛伐他汀3.3mg／kg灌胃，1次／日；模型组给予生理盐水0.2mL灌胃，1次／日；灌胃时间为8周。C57BL／6J小鼠给予正常饲料，作为正常对照组，给予生理盐水0.2mL灌胃8周。

1.2.2 透射电镜观察 剪取长约1mm主动脉弓，3%戊二醛前固定，0.2mol／L磷酸缓冲液冲洗3次，1%四氧化锇固定2 h，0.2mol／L磷酸缓冲液再冲洗3次，梯度乙醇脱水，环氧树脂包埋，制成超薄组织切片，醋酸双氧铀和柠檬酸铅溶液染色，置于铜网上，在H－7000FA透射电子显微镜下60－80kV加速电压，6 000～20 000放大倍率，观察动脉壁内皮细胞的超微结构变化，选取典型视野拍照。

1.2.3 血清oxLDL检测 小鼠麻醉后摘眼球取血1mL，4℃3 000r／min离心15min，分离血清。采用ELISA法测定血清oxLDL浓度。

1.2.4 总RNA提取及cDNA合成 取约1cm冻存的胸主动脉，用紫外分光光度仪测OD260／OD280，所有标本该值均在1.7～2.0。用Oligo dT、dNTP和 M－MLV在PCR热循环仪上将RNA逆转录为cDNA，反应条件为42℃60min，95℃5 min。

1.2.5 荧光实时定量RT－PCR检测CD40、VCAM－1的mRNA含量 小鼠CD40、VCAM－1与内参基因β－actin引物由上海博亚公司（Bio Asia）合成，引物序列为：CD40（157bp）上游 GCTATGGGGCTGCTTGTTGA； 下 游 ATGGGTGGCATTGGGTCTTC。VCAM－1（157bp）上 游 5’－TGCCGGCATATACGAGTGTGA－3’；下游5’－CCCGATGGCAGGTATTACCAAG－3’。β－actin（171bp）上游5’－CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC－3’；下 游5’－ATGGAGCCACCGA－TCCACA －3’。反应体系：cDNA 1μL，上下游引物各1μL，SYBR GreenI 10μL，加无菌双蒸水至20μL。反应条件：95℃预变性10s，57℃（CD40）、55℃（VCAM－1）、54℃（β－actin）退火5s，72℃延伸10s，共45个循环，最后40℃30s结束反应。采用Livak等[3]报道的2－ΔΔCT 方法对 CD40、VCAM－1的 mRNA 表达进行相对定量分析，VCAM－1的扩增倍数用比正常野生型C57BL／6J小鼠基因扩增的增高倍数表示。

2 结 果

2.1 血清oxLDL含量变化 模型组oxLDL与正常组相比明显增高（16.06ng／mL±4.16ng／mL vs 1.43ng／mL±0.84 ng／mL，P＜0.001）。与模型组相比，TPNS及辛伐他汀治疗后均明显降低apoE－KO小鼠血清oxLDL含量（16.06ng／mL±4.16ng／mL vs 4.45ng／mL±1.25ng／mL，3.92ng／mL±1.99 ng／mL，P＜0.001）。

2.2 主动脉内皮细胞超微结构改变 正常VEC为单层扁平细胞，连续性好，胞膜平整，胞浆均匀，紧贴内弹性膜，线粒体形态结构正常。内弹性膜连续，厚度均匀。模型组VEC可见细胞核固缩，有明显的内皮细胞脱落现象，并可见内皮细胞凋亡。胞核固缩，核内异染色质明显增多，边集于核膜下，线粒体空泡化，脊肿胀、溶解。三七总皂苷组、辛伐他汀组与模型组相比，VEC形态有不同程度的改善，胞浆内可见微丝及吞饮小泡，胞核内染色质相对均匀，线粒体数目略增多，形态结构基本正常，内皮连续无中断。内弹性膜连续，厚度均匀。

2.3 VCAM－1mRNA表达结果 模型组VCAM－1的mRNA表达较正常增高了7.65倍，TPNS干预组VCAM－1的mRNA表达下降至正常的4.38倍，辛伐他汀组下降至正常的3.11倍，差异有统计学意义（P＜0.001）。

2.4 CD40mRNA表达结果 模型组CD40的mRNA表达较正常增高了54.15倍，TPNS干预组CD40的mRNA表达下降至正常的15.52倍 ，辛伐他汀组下降至正常的16.19倍，其差异有统计学意义（P＜0.001）。

3 讨 论

血管内皮细胞层不仅是血液与组织间的屏障，而且是十分活跃的代谢及内分泌器官，VEC结构和功能的改变在心血管疾病的发生发展中起十分重要的作用。近年来，Ross提出的“损伤反应”学说认为，VEC的损伤和功能失调是AS发生的始动环节。oxLDL导致的内皮功能障碍在AS的病理过程中起关键作用。oxLDL具有细胞毒性，可引起内皮细胞结构及形态损伤，而且能够降低内皮细胞的抗纤溶活性和舒血管功能[4]。oxLDL还能够诱导内皮细胞表达多种黏附分子，增强单核细胞和T淋巴细胞的黏附及向内膜下移行，促进泡沫细胞的形成及AS斑块的发生发展。同时，oxLDL可刺激多种炎症因子如肿瘤坏死因子－α、白介素－1、白介素－8等的表达，加速 AS炎症反应[5，6]。

本研究用电镜观察小鼠主动脉内皮超微结构，正常小鼠主动脉内皮光滑完整，而动脉粥样硬化小鼠的主动脉内皮细胞有不同程度的损伤。模型组小鼠血清oxLDL水平明显高于正常组，三七总皂苷组小鼠血清oxLDL水平有显著降低，提示三七总皂苷可通过降低apoE－KO小鼠血清oxLDL水平保护血管内皮。

CD40属于肿瘤坏死因子受体超家族成员。AS斑块及培养的人VECs、VSMCs、M均可表达CD40及其配体CD40L，并且oxLDL可促进CD40、CD40L的表达[7]。CD40与其配体结合后可诱导VECs，VSMCs表达黏附分子如VCAM－1、细胞间黏附分子－1、E－选择素等，诱使免疫成分细胞黏附到血管壁[8]。并且还可以促进VECs，T细胞表达和释放化学因子如白介素－6、巨噬细胞炎性蛋白－1和单核细胞趋化因子－1等，吸引和支配T细胞、M到AS斑块内，维持慢性炎性反应，促进AS斑块的发展[9]。本研究中，模型组小鼠主动脉CD40基因有明显的表达，这与以往的研究相符。三七总皂苷组小鼠主动脉CD40的基因表达水平显著降低，这可能与三七总皂苷降低oxLDL的水平有关。

VCAM－1是一种重要的细胞黏附分子，属免疫球蛋白超家族成员，又称诱导性细胞黏附分子。VCAM－1通过与配体相互作用参与T细胞－T细胞、T细胞－基质杀伤细胞－靶细胞之间的相互作用，与炎症免疫反应密切相关[10，11]。VCAM－1可在多种促炎因子刺激的VECs，VSMCs中表达[12]，用基因敲除或抗体阻断VCAM－1的表达可降低单核细胞向内皮细胞的黏附，延缓AS进程[13，14]。本研究结果显示，模型组小鼠主动脉 VCAM－1的表达明显高于正常组，三七总皂苷组小鼠主动脉VCAM－1的表达较模型组显著降低，提示长期口服三七总皂苷可降低apoE－KO小鼠的主动脉VCAM－1的表达，抑制AS中免疫相关细胞的黏附，从而延缓AS的进展。

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