金晶,孙丽娜,梁米芳
抗狂犬被动免疫制剂研究进展
金晶,孙丽娜,梁米芳
102206北京,中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室
狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus,RV)引起的人畜共患疾病,一旦感染,如不及时采取有效防治措施,其病死率接近 100%。狂犬病的暴露后预防(post-exposure prophylaxis,PEP)是防治狂犬病的主要措施。为获得快速的保护作用,世界卫生组织建议,对于严重暴露者应同时使用注射狂犬疫苗和狂犬病毒免疫球蛋白(rabies immune globulin,RIG)进行主动和被动免疫治疗[1]。
狂犬病毒属于弹状病毒科()狂犬病毒属(),其基因组为不分节段的单股负链 RNA。基因组的 3' 端至 5' 端依次排列着 N、P、M、G 和 L 共5 个结构基因,分别编码核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和转录酶大蛋白(L)。糖蛋白(G)是狂犬病毒的主要保护性抗原,也是能诱导机体产生中和抗体的唯一抗原,在病毒致病和机体免疫过程中发挥关键作用[2]。研究显示,糖蛋白上至少存在 3 个主要的中和抗体结合位点:抗原位点 I、II 和III[3],其中抗原位点 I 为线性表位,抗原位点 II 和III 为空间构型表位。抗原位点 III 第 333 位精氨酸被认为是影响毒力的关键残基,其改变通常导致狂犬病毒毒力的丢失。一些狂犬病毒糖蛋白抗体能有效中和狂犬病毒,保护啮齿类动物抵抗致死剂量狂犬病毒的感染[4],因此,针对狂犬病毒糖蛋白被动免疫制剂的研究,对于促进狂犬病毒的机制研究和狂犬病毒的临床治疗都有重要意义。
对于狂犬病毒暴露者,接种疫苗 7 ~ 10 d 后才能产生中和抗体,在中和抗体未产生或抗体效价较低时,注射抗血清以抵御病毒侵袭就显得尤为重要。目前,市场上商品化的抗狂犬病毒被动免疫制剂都分离自免疫血清,根据其来源不同,分为人抗狂犬病毒免疫球蛋白(human rabies immune globulin,HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(equine rabies immune globulin,ERIG),如 Bayer 公司的人免疫球蛋白(BayRabTM)、巴斯德公司的马源抗狂犬病毒血清(ERIG PMC)以及北京生物制品研究所和武汉生物制品研究所生产的马源抗狂犬病毒血清。通常 HRIG 的使用剂量为20 IU/kg,ERIG 的使用剂量为 40 IU/kg,与疫苗联用保护率接近 100%[5]。我国的马抗狂犬病毒血清是用狂犬病毒作为抗原免疫马匹后,经测试血清抗体效价达到 100 IU/ml 时采集血浆,加入胃蛋白酶切除 Fc 段,并经一系列纯化工艺而成为商品[6]。由于 ERIG 有较重的副反应,而且对某些疫苗的抗体反应有抑制作用,美国免疫实践咨询委员会(ACIP)建议优先选用 HRIG[7-8]。但由于 HRIG 来源少,价格高,且存在潜在的污染风险,在狂犬病暴露后治疗中的应用也受到了限制。而无论 HRIG 还是 ERIG,其供应都远远不能满足狂犬病毒流行地区尤其是狂犬病高发的发展中国家的需求,因此寻找可靠的 RIG 替代品是目前研究的首要目标。
迄今为止,杂交瘤技术仍是最经典、应用最广泛的抗体制备技术。它的发展经历了早期的鼠源杂交瘤单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)9-10]和后期的人源杂交瘤单克隆抗体[11-12]两个阶段。1978 年,Wiktor 和 Koprowski 等[13]首次通过 B 淋巴细胞杂交瘤单克隆抗体技术获得了能够保护动物抵抗致死性狂犬病毒攻击的抗狂犬病毒单克隆抗体,此后多种抗狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体相继问世。1989 年,Schumacher 等[14]首次将狂犬病毒特异性的鼠源单克隆抗体制备成抗体鸡尾酒,在对攻毒小鼠及仓鼠的 PEP 中都显示了良好的保护性。“单克隆抗体鸡尾酒”疗法(cocktail of anti-rabies McAb,McAb-C)指利用狂犬病毒特异性单克隆抗体尤其是中和抗体替代狂犬病毒抗血清用于狂犬病的暴露后治疗。将不同表位的 mAbs 联用,既能起到类似多克隆免疫球蛋白的效果,又保留了 mAbs 特异性强和同质性高的优点[15]。1992 年,Dietzschold 等[16]发现对于受狂犬病毒攻击的小鼠,鼠源单克隆抗体 mAb1112-1 与 RIG 保护效力相当,对于中枢神经系统已被狂犬病毒侵入的小鼠,mAb1112-1 也具有一定的保护能力。2007 年,Muhamuda 等[17]获得了多株针对狂犬病毒糖蛋白的鼠源性单克隆抗体,其中和滴度及蛋白活性高于市场上的 ERIG 2000 倍,有望进一步研究以应用于人群暴露后预防。为使治疗性抗狂犬病毒抗体能在发展中国家得到更广泛的应用,Müller 等[15]于 2009 年开发了一种由 5 株鼠源单克隆抗体(E559.9.14、1112-1、62-7-13、M727-5-1 和 M777-16-3)组成的抗体鸡尾酒,其中 4 株抗体针对抗原位点 II,1 株针对抗原位点 III。用这 5 株抗体所组合成的 3 组抗体鸡尾酒进行体内试验,对攻毒仓鼠的保护率可达到 66% ~ 100%,均高于同等实验条件下的 HRIG 对照组(44%),因此有希望取代 HRIG 进行狂犬病毒暴露后预防。
不过鼠源性单克隆抗体在体内易被清除,可诱发人体产生人抗鼠抗体(human anti-mouse antibody,HAMA)或引起过敏反应,且鼠源性 Fc 段功能不能有效发挥,这些问题都使其在人体内的应用受到了局限,因此将鼠源单克隆抗体应用于临床狂犬病的预防治疗需要经过严密的筛选和实验。
基因工程抗体技术属于第三代抗体技术,其内容主要包括两部分,一是对已有的单克隆抗体进行改造,包括通过制备嵌合抗体和 CDR 移植抗体来实现抗体人源化、制备小分子抗体(Fab、ScFv、dsFv、diabody、minibody 等)和抗体融合蛋白;二是通过抗体库技术获得人源单抗。基因工程抗体的发展使得人源及人源化抗体的大量制备成为可能。
Dietzschold 等[12]于 1990 年获得的针对狂犬病毒糖蛋白的单克隆抗体 Mab57 是目前研究最为深入的人源杂交瘤单克隆抗体。Mab57 来自免疫后人外周血 B 淋巴细胞,经重组病毒表达系统在 BSR 细胞中制备,特异性针对抗原位点I(KLCGVL),能够高效和广泛地中和狂犬病毒,并对受狂犬病毒攻击的啮齿动物起保护作用。1991 年,Enssle 等[18]制备了特异性针对狂犬病毒糖蛋白的人源抗体 McAb TW-1,其在体外试验(RFFIT)和体内试验中对受试小鼠均表现出良好的保护能力。2000 和 2001 年,Champion等[19]和 Hanlon 等[20]分别获得针对未知位点的 Mab JA 及针对抗原位点II的 Mab JB。2003 年,Prosniak 等[4]对 Mab57、Mab JB 及 Mab JA 进行基因重组并在弹状病毒载体中表达,命名为 SO57、SOJA 及 SOJB,并将它们组成抗体鸡尾酒,对接受致死剂量狂犬病毒攻击的小鼠和仓鼠,仅接受一次抗体鸡尾酒的治疗即可显示出保护作用,在小鼠模型中运用该抗体鸡尾酒进行 PEP 可得到与 HRIG 相同的保护效力。2005 年,Marissen 等[21]通过 PER.C6 系统对这 3 株抗体进行改造,经由 BHK 或 CHO 细胞系表达,改名为CR57、CRJA 和 CRJB,结果显示,CRJA 中和活性较弱,而 CR57 和 CRJB 识别的抗原位点存在重叠,因此这3 株抗体不适合同时用于抗体鸡尾酒的调制。同年,Kramer 等[22]将从人源免疫库获得的 VH 和 VL 基因克隆入 PDV-C06 载体,并通过噬菌体展示技术进行筛选,得到一株针对抗原位点III的 scFv 形式的抗体 CR4098,这株抗体具有广泛的中和谱和与 CR57 互补的良好的中和活性。2006 年,Goudsmit 等[23]用 CR57 和 CR4098 制备抗体鸡尾酒,并同 HRIG 进行比较试验,结果表明 CR57/ CR4098 MAbs 能中和 26 株狂犬街毒株,20 IU/kg 的CR57/CR4098 与疫苗联用对受试小鼠保护率为 100%,同等剂量 HRIG 与疫苗联用保护率约为 92%,CR57/CR4098 表现出与 HRIG 相当的保护能力,证明了重组人源抗狂犬单克隆抗体替代抗血清是可行的。由 Crucell 公司开发的 CR57 和 CR4098 构成的单克隆抗体鸡尾酒 CL184 已经于 2008 年在美国和印度完成了 I 期临床,CL184 在疫苗注射后的免疫应答中表现出了良好的耐受性,且无不良反应发生[24];根据最新研究结果显示,CL184 的II期临床试验已经在美国和菲律宾完成,III期临床试验正在印度进行评估,距投入市场已不再遥远[25]。
2007 年,Sloan 通过可表达人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备了针对抗原位点III的人源单克隆抗体 17C7,17C7 具有广泛的中和谱,由马萨诸塞州生物实验室(MBL)和美国 CDC 合作完成的临床前实验显示,17C7 在剂量为 21、5 和 0.2 IU/kg 时对仓鼠的保护率分别为 95%、89% 和 89%,而 HRIG 在剂量为 37 IU/kg 时对仓鼠的保护率为 95%,提示在仓鼠模型中使用与 HRIG 相同或更低剂量的 17C7 即可达到与 HRIG 相同的保护效力[26];由 MBL 和印度血清学会共同赞助的I期临床试验已在印度完成,其在成人体内的安全性有待进一步评估[27]。2008,Nagarajan 等[28]通过免疫人的永生 B 细胞系获得单克隆抗体 R16F7 和 R14D6,用这两株抗体进行体内试验(使用剂量为 20 IU/kg),结果显示这两株抗体无论是单独与疫苗联用还是组成抗体鸡尾酒与疫苗联用,都能对受试动物起到保护作用。2009 年,Houimel 和 Dellagi[29]通过构建人源抗狂犬病毒 Fab 噬菌体抗体库,筛选获得了 6 株 Fab 抗体,其中 3 株特异性针对狂犬病毒糖蛋白III号位点。2010 年,Matsumoto 等[30]利用抗体库技术筛选到单克隆抗体 huMAbs No.254 和 4D4,huMAbs No.254 属于 IgG3 亚类且特异性针对抗原位点III,4D4 为 IgM 型抗体,其识别位点位于狂犬病毒糖蛋白抗原位点I和IV之间的某个区域。体内试验中,1 IU/kg 剂量的 No.254 可对小鼠有 50% 的保护率,略逊于同等剂量下 ERIG 对小鼠的保护率(70%)。2012 年,Sun 等[31]利用 pComb 3H 噬菌体抗体库系统筛选到 5 株针对位点II的 Fab 抗体,这 5 株抗体均属于 IgG1 亚类,在体外试验(RFFIT)和体内试验中对受试小鼠均表现出良好的保护能力。2012 年,重组人源抗狂犬单克隆抗体 SII RMAb 已在印度完成为期一年的I期临床试验[32]。以上结果均表明人源单克隆抗体安全有效,且保护率与 RIG 相当,可取代 RIG 用于暴露后预防。
小分子抗体因结构简单、分子量小、穿透性强、生产成本低廉等优点而备受人们关注,基因工程抗体技术的发展使各种小分子抗体的构建和表达成为可能。狂犬病毒从中枢神经系统的清除机制与体内病毒的清除机制不同[33],而小分子抗体(如 Fab)通过血-脑脊液屏障的能力强于全抗体,因此有可能将狂犬病毒从中枢神经系统中清除[16,34]。scFv 是目前研究最广泛的一种小分子抗体,Yokota 等[35]发现 scFv 可以穿透远处肿瘤组织和血-脑脊液屏障这种特性可用于狂犬病毒急性感染的治疗。针对小分子抗体在血液中不稳定的特点,研究人员尝试通过基因工程技术对抗体分子进行各种形式的改造来解决这个问题。王丁丁等[36]通过毕赤酵母人抗狂犬病毒抗体 scFv-Fc 分泌表达文库筛选获得具有较高亲和力的 scFv-Fc 抗体。Duan 等[37]在 scFV-57 的VH44 位及 VL100 引入 Cys 形成 ds-FV57,并将 VL85 位的 Cys 突变为 Ser,结果显示,相较于 scFV-57,ds-FV57VL85Ser的稳定性和体外中和能力都得到了很大提升。
虽然到目前为止,还没有任何一种治疗性抗狂犬单克隆抗体实现商品化,但许多研究已进入临床前实验或临床观察阶段。与此同时,针对抗狂犬被动免疫制剂大规模生产的研究也取得一定进展,研究人员已通过利用动物细胞以及转基因植物等获得了狂犬单克隆抗体及多克隆抗体的高效表达;在我国,华北制药集团已经得到高水平表达人源化抗狂犬单抗HuMAbs(NM57)的工程细胞株,具备一定的生产能力。随着研究的继续和深入,各种新型抗狂犬被动免疫制剂的商品化生产将成为可能,人源单克隆抗体及单克隆抗体鸡尾酒有望很快取代人 HRIG 和 ERIG 应用于临床治疗。
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10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2013.02.011
梁米芳,Email:mifangl@vip.sina.com