GAD65 真核表达载体的构建及其在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

赵元淑，罗淼珊，邓 镇，谢 柳，余 涵，胡景鑫，朱晓琴，雷水生

颞叶癫痫是难治性癫痫的一种，主要病理表现为海马硬化和神经元丢失。传统的手术治疗会出现言语记忆减退等副作用［1］。研究表明细胞移植可以产生显著的疗效［2］。γ-氨基丁酸(GABA)是脑内重要的抑制性神经递质，具有抑制癫痫发作的作用。谷氨酸脱羧酶(GAD)是GABA 合成的唯一的限速酶，GAD 的含量和活性直接决定GABA 的浓度。GAD65 是GAD 的一种亚型，在发挥持续抑制、调节癫痫活动中起重要作用［3］。提高脑内GAD65 的浓度可以促进GABA 的生成，而使用GAD65 修饰的骨髓间充质干细胞移植治疗癫痫尚未见报道。本实验构建了GAD65 真核表达载体，转染大鼠骨髓间充质细胞，并对其在细胞中的表达做了初步鉴定，为进一步干细胞移植奠定了实验基础，为基因治疗和细胞移植联合治疗癫痫提供了实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及动物 真核表达载体pCDNA3.1 购于深圳百恩维公司，大肠杆菌DH5α 购于天根生化公司，小量质粒抽提试剂盒购于北京全式金生物公司，限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 连接酶购于美国NEB 公司，RNA 提取试剂盒、PCR 试剂盒购于Takara，Lip2000、Trizol 购于Invitrogen，一抗来自Abcam;二抗购于北京中杉金桥，胎牛血清FBS、低糖DMEM 购于Gibco。动物:成年SD 大鼠及4 周龄SD大鼠，由广州医科大学实验动物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表达载体构建及鉴定 成年SD 大鼠脑组织50mg，液氮中研磨，按Trizol 说明书步骤提取鼠脑总RNA。以鼠脑总RNA为模板，以Oligo(dT)为引物，逆转录生成GAD65 的cDNA。根据Genbank 提供的大鼠GAD65 编码序列设计引物。上游引物5’-AGTGAATTCAGAACCCATGGCATGGCATCTCC-3’，下游引物5’-CGTCCAGCTCGAGCAAAGTGATTACAA-3’。上下游引物分别加入EcoRⅠ、XhoⅠ酶切位点。以cDNA 为模板，用高保真DNA 聚合酶对GAD65 基因进行扩增。PCR 扩增条件:94℃预变性4min，94℃30s，59℃3min，37 个循环，最后72℃延伸8min。PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的片段。EcoRⅠ、XhoⅠ酶切GAD65 和pCDNA3.1 真核表达载体，回收目的基因片段和pCDNA3 真核质粒片段。用T4 连接酶将上述两片段定向连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌DH5α，将转化后的菌液涂布于LB 琼脂平板上，挑取白色克隆接种在LB 培养基中。抽提重组质粒，该质粒命名为pCDNA3.1-GAD65。用限制性内切酶EcoRⅠ、XhoⅠ酶切该质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送上海英潍捷基公司测序。

1.2.2 大鼠骨髓间充质干细胞细胞分离培养及转染 取4w 健康雄性SD 大鼠1 只，脱颈处死后浸泡于75%酒精中5min，于无菌条件下取出双侧股骨、胫骨，迅速放于PBS 中，剪除骨膜及软组织(尽量剪干净)，切断干骺端，暴露骨髓腔，取5ml 注射器吸取培养液(10%FBS，1%双抗，90%DMDM)反复冲洗骨髓腔，直至骨髓腔变白为止。将冲洗液反复吹打均匀，接种于100mm 平皿，置于37℃、CO2培养箱中。24h、48h 全换液，以后隔天全换液。5～7d细胞长满平皿底，细胞达到90%融合时用胰酶消化，1∶2 传代。倒置显微镜观察细胞生长状况，2～3d 传代一次。转染前一天将P3 代细胞接种于六孔板中以备转染。将待转染的BMSCs 分成3 组:A组:转染pCDNA3.1-GAD65 组;B 组:转染空质粒pCDNA3.1 组;C 组:未转染组。将DNA 和脂质体按1∶3 的比例分别加入250μl 无血清培养基Optimem 中，混合反应20min;吸出培养皿中的细胞培养液，PBS 冲洗两遍，加入1.5ml Opti-mem，将DNA、脂质体混合液加入6 孔板(C 组只加无血清培养基)，反应6h 后，吸出转染液，加入正常培养液;细胞培养48h 后进行各项指标检测。

1.2.3 逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测mRNA 表达 吸出细胞培养液，PBS 冲洗一遍，加入1ml Trizol，提取总RNA，按逆转录试剂盒步骤逆转录成cDNA;以cDNA 为模板，上游引物5’-ACGCACTGCCAAACAACTCTA-3’，下游引物5’-GACATCAGTAACCCTCCACCC-3’进行荧光定量PCR。扩增条件:95℃30s;95℃5s;60℃34s;共40 个循环。溶解曲线设置为:95℃ 15s;60℃ 1min;95℃15s。用△△CT 值比较法处理数据。

1.2.4 免疫荧光检测BMSCs 中GAD65 的表达 吸出细胞培养液，PBS 冲洗3 遍，冰甲醇固定10min，0.3%TritonX-100 室温通透10min，山羊血清室温封闭30min，一抗4℃封闭过夜，次日复温30min 后;二抗37℃避光孵育2h，DAPI 染核，5%甘油封片镜检。

1.2.5 Western blot 检测蛋白表达 细胞转染48h 后吸出培养液，用预冷PBS 冲洗3 遍，加入细胞裂解液，提取细胞总蛋白，BCA 法测蛋白浓度，取适量蛋白行SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白用湿法转膜转印到PCDF 膜上，5%脱脂奶粉封闭1h，一抗4℃封闭过夜，TBST 洗膜，加入二抗室温孵育1h，TBST洗膜，ECL 发光显影。

2 结果

2.1 pCDNA3.1-GAD65 真核表达载体构建及鉴定 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切重组质粒，琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定结果显示:1～4 泳道均显示扩增出1758bp 大小的目的基因片段和大小为5428bp 的pCDNA3.1 基因片段，与预期大小一致。将菌落PCR 和重组质粒双酶切鉴定均为阳性的克隆送往公司测序，并与Genbank 中GAD65 的基因序列比对。测序结果显示，目的基因序列与NCBI 公布的参考序列完全一致，无读码框移，以上结果证明pCDNA3.1-GAD65 重组真核质粒构建成功。

2.2 RT-PCR 检测转染后BMSCs 中GAD65 mRNA 的表达 细胞转染24h 后，提取各组细胞总RNA，检测GAD65 mRNA 在各组骨髓间充质干细胞中的表达。实时荧光定量PCR 检测结果显示:pCDNA3.1-GAD65 转染组的GAD65 mRNA(203911.668±16064.279)较未转染组(0.835±0.183)和pCDNA3 空质粒转染组(0.461±0.129)有明显的升高(P＜0.05)，而未转染组和pCDNA3.1 空质粒转染组相比，差异不显著，无统计学意义(P＞0.05)。

2.3 免疫荧光检测BMSCs 中GAD65 的表达免疫荧光检测各组GAD65 蛋白表达情况，并且初步估计转染率。pCDNA3.1-GAD65 转染组显示GAD65 蛋白在细胞浆内均匀表达，而未转染组、pCDNA3.1 空质粒转染组未见GAD65 表达。这证明pCDNA3.1-GAD65 能够成功地被转染到骨髓间充质干细胞中，并正确过表达目的蛋白。

2.4 Western blot 检测BMSCs 中GAD65 的表达 Western blot 检测pCDNA3.1-GAD65 转染组、pCDNA3.1 空质粒转染组、未转染组GAD65 蛋白表达情况。结果显示pCDNA3.1-GAD65 转染组过表达GAD65 蛋白，而pCDNA3.1 空质粒转染组、未转染组未检测到GAD65 蛋白表达。

3 讨论

癫痫是由于大脑神经元突发性异常放电导致大脑功能障碍的一种慢性疾病。癫痫的发作与中枢神经系统中神经递质的兴奋-抑制失衡有关［4～6］。部分难治性癫痫患者可以接受手术治疗，但并非所有难治性癫痫患者都适宜手术，特别是癫痫灶弥散或不明确者并不具备传统手术的手术指征，而且传统手术远期疗效只有60%左右，因此有必要探索更安全、更有效的新治疗方案。

近年来，干细胞移植治疗癫痫的方法越来越获得关注，因为干细胞具有产生内源性抗惊厥物质、替换损伤神经元的作用，可以用于癫痫的治疗［7，8］。但是，由于胚胎干细胞、神经干细胞等在取材方面存在限制，严重影响了其在临床中的应用。骨髓间充质干细胞(BMSCs)免疫原性小，取材方便，能诱导分化成骨软骨、脂肪、心肌、神经元等各种细胞［9］。这些特点让骨髓间充质干细胞在科学实验和临床治疗中获得更多的应用［10］。骨髓间充质干细胞移植已经在治疗脊髓损伤和自身免疫性疾病方面取得了显著的治疗效果［11，12］。因此，骨髓间充质细胞在移植中可以作为一个理想的种子细胞。

γ-氨基丁酸(GABA)是脑内一种重要的抑制性神经递质，癫痫的反复发作可以引起脑内GABA 能神经元缺失，从而导致不同程度的癫痫发作［13］。向脑内定向移植GABA 能细胞可以抑制癫痫的发作。谷氨酸脱羧酶(GAD)是GABA 合成的限速酶，其存在两种异构体，即GAD65 和GAD67。GAD65 主要存在于神经突触中，GAD67 则均匀地分布于神经元的胞体。两种异构体由于活化和细胞定位不同而被赋予不同的功能。GAD67 基因敲除的小鼠先天发育异常，出生后不久死亡;而GAD65 基因敲除的小鼠出现癫痫自发性发作［14］。因此，GAD65 在癫痫的发作中具有重要的作用。GAD65 基因修饰BMSCs 可以在短时间内产生高浓度的GAD65，移植GAD65-BMSCs 可以起到补充GABA 能细胞的作用。

通过基因工程化细胞治疗疾病是近期研究的热点。将基因转染入特定的细胞中，使其过表达或沉默某种基因，从而达到治疗疾病的目的。本实验将GAD65 基因导入骨髓间充质干细胞，以期注入脑内产生高浓度的抑制性神经递质GABA，从而达到治疗癫痫的目的。

在实验中我们依据真核质粒安全、无病毒突变危险、可以应用于临床等优点，构建pCDNA3.1-GAD65 真核载体，并将其转染大鼠骨髓间充质干细胞，通过RT-PCR、免疫荧光、Western-blot 等鉴定，证实GAD65 基因在转染的细胞中能够正确表达，这为进一步探索携带GAD65 的骨髓间充质干细胞治疗癫痫奠定了前期实验基础。

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