ATP 受体通道激活增加谷氨酸对海马神经元的损伤

李晓娟，郭直岳，王亚莉，赵建华，白瑞樱，路承彪

研究表明，ATP 不仅是组织细胞的供能物质，还是一种具有兴奋性作用的神经递质，能调节中枢神经系统快速的神经传递。神经末梢突触囊泡内储存着ATP 并能在特定的刺激下释放［1］。正常情况下，释放到胞外的ATP 量很少，当脑受到损伤(如缺血缺氧)时，大量ATP 释放到胞外，使胞外的ATP 水平迅速升高，与细胞膜上的受体结合，继而引发系列反应，使细胞膜通透性增加，导致细胞凋亡坏死，引起继发性脑损伤［2］。ATP 受体属于P2 嘌呤能受体，分为P2X 受体和P2Y 受体两类。P2X 受体是一种非选择性的阳离子通道蛋白，允许一价阳离子如Na+和K+及二价阳离子如Ca2+通过。P2Y 受体是G-蛋白耦联的代谢型受体，该受体激活磷脂酶C(PLC)，导致钙从肌浆网中释放。

Glu 是人脑内含量最高的兴奋性氨基酸。正常情况下，谷氨酸参与多种生理功能的调控，但过量的谷氨酸对神经元有损伤作用。许多病理情况如缺血、癫痫、神经退行性疾病(阿尔兹海默症和帕金森病、肌萎缩侧索硬化症)等都与谷氨酸兴奋毒性介导的神经细胞死亡密切相关［3］，Glu 受体有3 种，分别是NMDA、KA 和AMPA 受体。Glu 受体的过度激活引起Ca2+内流增加被认为与这些病理改变有关。

Paul Brown［4］等发现，除了作为快速神经递质外，ATP 还作为神经系统一种兴奋性谷氨酸能突触所激活的产物，表明二者之间有一定的联系。在大鼠皮层和海马的锥体细胞中，P2 嘌呤能受体拮抗剂能改变谷氨酸的NMDA、KA 或AMPA 受体。近期的研究表明P2X 受体和AMPA 受体共同存在于小脑和海马的兴奋性突触后膜上，在兴奋性突触上P2X 受体亚基的出现表明谷氨酸能和嘌呤能传递之间存在相互作用［5］。

因此本研究假设ATP 信号通路可能改变了神经退行性变的过程，研究采用ATP、Glu 单独或共同处理原代培养的海马神经元观察细胞死亡情况，通过全细胞电压钳放大器记录海马神经元电流变化，探讨胞外ATP、Glu 对海马神经元的作用及其机制。

1 材料和方法

1.1 材料 孕鼠购自郑州大学动物中心［许可证号:scxk(豫)2005-0001］;ATP、glutamate、谷氨酰胺、胰蛋白酶均购自Sigma 公司;DMEM、NB(neurobasal)、B27 培养基、胎牛血清均购自Gibco 公司;Axon 全细胞电压钳放大器购自Molecular Device。

1.2 方法

1.2.1 海马神经元培养［6］及实验分组 孕18d 胎鼠迅速取出海马组织，置于D-Hanks 液中洗涤3 次，剪碎加入终浓度0.125%胰蛋白酶消化液中，37℃消化20min，用含10% 胎牛血清的冰冷DMEM 液中止消化，静置2min 去除中止液，加入DMEM 液制成7×105cells/L 密度的细胞悬液，接种于涂有0.05%多聚赖氨酸的培养皿中(35mm)，6h后更换NB+B27+谷氨酰胺培养基，3d 后半量换液，37℃恒温CO2孵箱内培养。细胞培养至第7 天进行实验。实验分为正常对照组、ATP 组、Glu 组和ATP+Glu 组。正常对照组:NB+B27 培养基常规培养;ATP 组:更换为特定浓度的ATP 工作液后观察;Glu 组:更换为特定浓度的Glu 工作液后观察;ATP+Glu 组:更换为特定浓度的ATP+Glu 工作液后观察。

1.2.2 海马神经元存活率检测 用0.125%的胰蛋白酶消化贴壁的神经元，并用含15%胎牛血清的DMEM 培养基中止消化，充分吹打细胞悬液，取9 滴细胞悬液移入试管中，加1 滴0.4%台盼蓝溶液混匀，3min 内用血细胞计数板在倒置相差显微镜下分别计数活细胞和死细胞(蓝染细胞)。神经元存活率=未蓝染细胞/(蓝染细胞+未蓝染细胞)×100%，实验重复3 次。

1.2.3 全细胞或膜外面向外式膜片钳记录同先前使用方法［7］。打开数模转换器和膜片钳放大器，通过显微镜和CCD 可视下挑选状态较好、突触完整、边界折光度好的神经元;电极电阻大约为3-5M，高阻抗封接，形成全细胞记录模式。应用膜片钳放大器记录电流，2kHz 滤波，采样频率为5kHz(Digidata 1320，Axon Instruments)，pCLAMP-8 型软件进行数据记录和分析。

1.3 统计学处理 所有统计均采用SPSS13.0软件在计算机上进行随机区组设计的单因素方差分析(one-way ANOVA)，各组数据以均数±标准差(±s)表示。

2 结果

2.1 ATP 和Glu 对细胞死亡率的影响 相差显微镜显示正常培养条件下。海马神经元折光性强，胞体饱满，有明显的立体感，周围有一圈亮晕，神经突起多并延长交织成网状。采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分别处理后，观察到明显神经元细胞死亡，细胞形态变圆，突起变短，台盼蓝计数细胞存活率，对照组存活率在90%以上，采用ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分别处理原代培养的海马神经元24h。单独给予低剂量ATP 引起大约30%的神经元死亡，单独给予Glu 引起大约50%的神经元死亡，ATP 和Glu 联合给予引起接近100% 神经元死亡(P＜0.05)。

2.2 ATP 和Glu 诱导的全细胞电流 在离体培养7d 的海马神经元上，固定膜电位在－70mV，记录全细胞电流。低剂量ATP(100μmol/L)诱导的电流很微弱，Glu(100μmol/L)可诱导约300pA 的内向电流(P＜0.05)，ATP(100μmol/L)和Glu(100μmol/L)联合应用诱导较大的内向电流(P＜0.05)。三者之间的比较，表明ATP 提高了谷氨酸诱导的电流。

2.3 膜外面向外式(outside-out)膜片钳记录ATP 和Glu 诱导的离子电流 在全细胞记录完成后，开始膜片钳记录。单独应用ATP(100μmol/L)没有诱导明显的内向电流，单独应用Glu(100μmol/L)诱导了微弱的内向电流，二者同时使用诱导了较大的内向电流(P＜0.05)，表明ATP 提高了Glu 诱导的内向电流。

3 讨论

兴奋性毒性是由兴奋性神经递质对受体的过度持续活化导致的神经元死亡过程［8］。20 世纪50 年代Holtol 发现感觉神经兴奋时释放ATP，首次证实了ATP 可以作为神经系统的递质，提示ATP 在神经兴奋传递中具有实际意义。ATP 与离子门控型P2X 受体结合可导致细胞膜通透性增加，促使大量Ca2+内流，最终导致靶细胞死亡［2］。谷氨酸作为人脑内含量最高的兴奋性氨基酸，当其NMDA 受体过度兴奋时大量Ca2+内流，使细胞内Ca2+超负荷，引起Ca2+稳态失调，从而激活依赖于钙的酶系统引起一系列的细胞损伤。

本实验通过光学显微镜观察到ATP 及Glu 作用于海马神经元后，细胞形态变圆，突起变短。台盼蓝计数显示，ATP(100μmol/L)、Glu(100μmol/L)以及ATP+Glu(100μmol/L+100μmol/L)分别处理后海马神经元死亡率依次增加，表明ATP 受体通道激活与Glu 对海马神经元的损伤有协同作用。为进一步探讨ATP 与Glu 对海马神经元的损伤机制，我们应用全细胞电压钳放大器，单独给予ATP 与Glu 或联合诱导全细胞电流和膜片钳记录电流。

实验结果均表明，单独给予100μmol/L ATP 没有明显的电流产生，可能与使用的ATP 剂量低有关，Skaper 等［2］报道ATP 引起的细胞死亡多为mmol 的剂量，而我们使用的剂量为μmol/L 级的;100μmol/L Glu 可诱导较大的内向电流;二者共同作用增加了电流大小，表明ATP 与Glu 的协同作用。

Domercq 等［9］报道脑缺血损伤是由于ATP 失稳态。脑缺血时ATP 释放增多，激活P2X7 受体导致显著的钙超载，是卒中等缺血性疾病的关键。脊髓创伤［10］也与ATP 受体P2X7 激活导致的兴奋性毒性有关，应用P2X7 抑制剂可减轻脊髓损伤。

谷氨酸引起的神经元损伤更是被人们所公认作为兴奋性神经毒性模型复制的方法［11］。Eftinija等［12］报道体外培养 Schwann 细 胞，给 予 ATP(100μmol/L)引起受体介导的兴奋性递质谷氨酸和天冬氨酸增加，提示在胶质细胞中ATP 可以提高谷氨酸浓度，这与我们在海马神经元培养中观察到的ATP 受体通道激活增加谷氨酸对海马神经元的损伤结果是一致的。但是关于两种兴奋性递质对神经元的共同作用并未见报道，本实验结果提示ATP 和Glu 可能同时打开各自的受体通道导致更显著的钙超载，从而引起更严重的细胞损伤。

探讨ATP 和Glu 对神经元的作用，对与兴奋毒性有关的紊乱诸如卒中等缺血性疾病、癫痫、阿尔兹海默症和帕金森病、肌萎缩侧索硬化症等神经退行性疾病的发病机制可能提供重要证据。在这些疾病的发生发展过程中可能存在这两种受体通道的同时打开，从多个通道进行阻断可能成为治疗这些疾病的新的靶点。

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