BCRP/ABCG2的结构功能及相关抑制剂研究

应帅，郑婷婷，陈培远，郭辉辉，许传莲

化学治疗是临床上治疗癌症的一种主要方式。研究发现多重耐药菌（multi-drug resistance，MDR）主要是由一类被称为ABC 转运蛋白超家族（ATP binding cassette transporters）的膜蛋白所引起的，它们能够利用 ATP 水解提供的能量将化学治疗药物排出细胞外，导致肿瘤细胞呈现抗药性。BCRP/ABCG2（breast cancer resistant protein）属于ABC 转运蛋白超家族 G亚族的第二位成员，是造成多种癌细胞产生 MDR的主要原因之一。

乳腺癌耐药蛋白（BCRP）由一个位于N 末端的核苷酸结合结构域（NBD）和一个位于C 末端的横跨膜结构域（MSD）组成，被称为半转运蛋白，因此 BCRP 很有可能是形成同源二聚体或低聚物发挥功能。

BCRP 不仅分布于多种肿瘤细胞中，而且还广泛分布于人体的正常组织中，如脑、胎盘、小肠、肝脏、睾丸、卵巢、前列腺等[1]。BCRP 转运许多在结构和功能上不相关的外源性药物如米托蒽醌、喜树碱及其衍生物 SN-38等，同时也能够转运多种内源性物质。因此，BCRP 在药物体内的吸收、分布、排泄中都发挥了重要作用[2]。

此外，BCRP 在肿瘤细胞的侧群细胞中高表达，可以作为干细胞检测的标记物[3]，并且已发现多种潜在的BCRP抑制剂，如 FTC（fumitremorgin C）及其衍生物 Ko143等。但是关于BCRP的三维结构及其分子作用机制尚不清晰，还有待进一步的研究。

1 ABCG2的发现

BCRP 由 Doyle等[4]从阿霉素抗性的MCF-7 乳腺癌细胞株 MCF-7/AdrVP 中首先克隆得到的。随后，Miyake等[5]从米托蒽醌抗性的直肠癌细胞株，Allikmets等[6]从人类胎盘组织中相继克隆得到类似基因，分别命名为MXR和ABCP。BCRP、MXR和ABCP 作为同源蛋白，只有个别氨基酸序列存在差异，依据人类基因命名委员会的推荐，将该蛋白统一命名为ABCG2。BCRP 属于ABC 跨膜转运蛋白超家族 G亚族的第二位成员，与P 糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）、多药耐药相关蛋白 1（multidrug resistance associated protein 1，MRP1）同为常见的3 种药物抗性蛋白。

2 BCRP的结构与功能

BCRP 基因位于染色体 4q22，全长 66 kb，由 16个外显子和15个内含子组成，编码 655个氨基酸，蛋白大小为72 kD。BCRP 仅由一个 ATP结合域和一个由 6个α 螺旋结构的横跨膜结构域组成，与其他的全转运蛋白P-gp 或 MRP1（含两个或两个以上的MSD和NBD结构）相比，BCRP 属于半转运蛋白[7]。一般情况下，半转运蛋白位于细胞内，而全转运蛋白位于细胞膜。BCRP是第一个被发现位于细胞膜上的ABC 半转运蛋白[8]。此外，BCRP 在结构上与其他亚族的转运蛋白如 P-gp、MRP1 存在明显差异，其 ATP结合结构域位于N 端，而跨膜结构域位于C 端。正是由于BCRP 具有这些独特的结构特征，越来越受到研究者的关注。Wang等[9]的研究结果首次证明了 BCRP的MSD 氨基和羧基末端位于细胞内的6-TM模型，这些研究结果对于了解 BCRP 转运机制具有重要的作用。

一般认为，一个功能性的ABC 转运蛋白需要两个或者两个以上的MSDs和NBDs 才能形成一个底物转移通道。因此，BCRP 作为半转运蛋白很有可能是形成同源二聚体或低聚物而发挥功能的。Ni等[10]运用双分子荧光互补技术，并结合荧光共振能量转移（FKET）检测了 BCRP 二聚体/低聚物的形成。有报道认为ABCG2是通过分子内二硫键的连接形成功能性的同源二聚体结构[11]，Kage等[12]的早期研究发现在还原条件下，聚丙烯酰胺凝胶电泳上得到的BCRP 分子量为70 kD；而在非还原条件下，得到了 140 kD的化合物，这一结果预测 BCRP 通过二硫键形成了同源二聚体。Liu等[13]研究结果显示，Cys284、Cys374和Cys438三个 Cys 残基共同发挥作用，维持人源 ABCG2-R428G的功能。而位于第三个细胞外环（Loop-3）上的Cys 残基（如Cys592、Cys603和Cys608）发生突变，并不影响 ABCG2的功能；与之相反的是，Shigeta等[14]研究认为BCRP 作为一种功能性的转运蛋白，并不需要形成 Cys 介导的共价二聚体，此外，位于Loop-3 上的Cys603和Cys608 或许也参与了 BCRP 二聚体的形成；而新的研究显示，由于分子间的非共价键的相互作用，ABCG2 或许以一种更易形成的低聚物形式存在。Xu等[15]通过对 TM5-loop-TM6 重组片段研究发现，该片段能够形成寡聚化，因此认为该区域对于BCRP的寡聚化非常重要。

总之，关于BCRP 最小的功能单元是否是同源二聚体以及是否以二聚体/低聚体的状态发挥与药物结合与转运的功能，目前尚未有确论。BCRP 形成功能性二聚体/低聚体或许是由于分子内二硫键形成、分子间非共价蛋白与蛋白相互作用共同发挥作用的结果，这些需要对 BCRP 形成同源二聚体或低聚物的机制进行更深入的研究[16]。

3 BCRP的组织分布及在药物代谢中的作用

BCRP 定位于细胞膜，关于BCRP的蛋白表达和mRNA 已在多种类型的人类癌症中检测到，包括恶性血液肿瘤和一些固体瘤。ABCG2 在食管鳞癌中呈高表达，不仅与肿瘤的分化、患者临床分期有关，还与有无淋巴结转移密切相关，因此 ABCG2 可能是导致食管鳞癌患者化疗不敏感的主要原因，尤其是中晚期患者[17]。

BCRP 主要分布在具有分泌和排泄功能的组织中。因此，BCRP 作为一种高效的外排泵对药物和外源性物质在体内的吸收、分布、排泄等过程中发挥着重要作用，越来越多的研究认为BCRP 在药物的处理和组织保护中也起到了重要作用[1-2]。Enokizono等[18]研究显示，BCRP 限制了外源性化合物如 MeIQx、PhIP、Prazosin等在脑和睾丸中的分布，与P-gp 共同形成了血脑屏障；Cisternino等[19]研究表明 ABCG2 存在于鼠血脑屏障中并发挥了重要的生理学功能，ABCG2的表达能够有效地限制脑对米托蒽醌和哌唑嗪的吸收，限制药物渗透进入脑，并造成潜在的药物相互作用。由于BCRP 在血脑屏障中主动外排治疗药物，降低药物在脑部的药效，因此需要设计一些新的策略来避免中枢神经系统中由 BCRP 介导的多药耐药。Mahringer和Fricker[20]研究发现，17β 雌激素通过活化大鼠脑部毛细血管的ERβ，从而下调 BCRP的转录和翻译水平，这一结果有助于提高中枢神经系统疾病（如脑癌）中 BCRP 底物的靶向性治疗，也有助于了解在长期摄入植物雌激素和口服药物过程中BCRP 与药物之间的相互作用。Hirano等[21]研究显示，在人源或鼠源 BCRP 表达系统中，BCRP 识别并参与肝胆对匹伐他汀的外排作用，这与MRP2 主要介导了肝胆对他汀类的外排作用的观点相反。Merino等[22]研究发现 BCRP是呋喃妥英生物利用度的一个重要决定因素，并参与肝胆将呋喃妥英分泌至乳汁中，但在呋喃妥英的泌尿排泄中并未发挥实质性的作用。

4 BCRP的转运底物

近些年来的研究发现 BCRP 具有广谱的转运底物，主要分为外源性底物和内源性物质，发挥对组织器官的保护和解毒作用。

4.1 外源性底物

首先，BCRP能有效地外排抗癌化学治疗药物，如米托蒽醌、喜树碱类（拓扑替康、伊立替康及其代谢物SN-38）、叶酸拮抗剂（甲氨蝶呤）、表鬼毒素（伊托泊苷、替尼泊苷）、黄酮类抗肿瘤药物（flavopiridol）等，同时也能转运一些新型的分子靶向类药物，如酪氨酸激酶抑制剂（伊马替尼、吉非替尼）和脂肪酸酰胺类水解酶抑制剂（达努塞替）；其次，BCRP 也能主动转运一些荧光染料类化合物如 BOPIPY-Prazosin、罗丹明 123、Hoechst33342、Lyso-Tracher，这些荧光性底物常用于研究 BCRP的表达水平和转运功能。此外，BCRP 还能转运一些化学毒素，如pheophorbide a、PhIP等[16-23]。

4.2 内源性底物

BCRP能转运对细胞生理学动态平衡起重要作用的内源性化合物，如固醇类（胆固醇、雌二醇、类固醇）及其类固醇硫酸盐（E3S、DHEAS）[24-25]、血红素、卟啉[26]、核黄素[27]、硫酸盐化的雌激素[28]以及某些叶酸和抗叶酸剂[29]等。

5 BCRP的抑制剂

克服多药耐药的方法就是利用一些高效的调节剂来抑制 ABC 转运蛋白的作用。已发现越来越多的化合物可作为BCRP的抑制剂，本文根据各种化合物的特性将 BCRP的抑制剂分为四类。

5.1 BCRP 特异性抑制剂

主要包括 FTC 及其类似物、新生霉素等。FTC是一种从烟曲霉中分离得到的霉菌毒素，在体外能特异性逆转由BCRP 介导的多药耐药，增加抗癌药物的细胞毒性，因此FTC 被广泛用于检测 BCRP 在MDR和药物处理实验中的药理学探针[30-31]。Gonzalez-Lobato等[32]研究结果表明，人源 BCRP 对 FTC的抑制效果比鼠源 BCRP1 更为敏感。这种选择性抑制对于研究体内细胞毒性和药理作用具有重要作用，可用于BCRP1/BCRP 抑制剂的研发。

FTC 虽然是一种高效、特异性强的BCRP 抑制剂，但由于其具有神经毒素作用而限制了在体内的使用。Allen等[33]鉴定了新的FTC 四环类似物 Ko132、Ko142和Ko143，这三种FTC 类似物能有效地抑制人源 BCRP和鼠源的BCRP1的功能，增加细胞内药物的积累，并逆转BCRP1/BCRP 介导的多药耐药，同时对 P-gp和MRP1等ABC 家族转运蛋白的抑制活性较低。此外，它们在高口服剂量的小鼠体内没有任何毒性。Ko143能抑制鼠小肠中BCRP1的功能，并显著增加拓扑替康在小鼠体内的口服利用度，这是第一个适用于体内的高效特异性 BCRP 抑制剂。此外，新生霉素作为一种从链霉菌中产生的抗生素，能增加拓扑替康在MCF/TPT300 细胞中的积累，特异性抑制BCRP的外排作用[34]，有望发展为用于临床治疗中 BCRP的候选抑制剂。

5.2 ABC 转运蛋白家族的广谱特异性抑制剂

GF120918（elacridar）是一种有代表性的第二代 P-gp抑制剂，现已证明对 BCRP和MRP1 具有一定的抑制活性[35]。根据 GF120918的结构进行改造和修饰的衍生物如tariquidar（XR9576）也抑制 BCRP的药物外排作用。Pick等[36]以 tariquidar 为先导结构设计得到了一些新型有效且特异性强的BCRP 抑制剂；Kühnle等[37]通过对 tariquidar苯甲酰胺核心结构进行修饰，合成得到的化合物是迄今为止所发现的最有效、特异性强的BCRP 抑制剂之一。

抗 HIV 药物作为一种逆转剂广泛应用于逆转由 BCRP介导的MDR，研究发现 BCRP 表达于CD4+T 细胞株，对核苷逆转录酶抑制剂具有耐药性，可作为提高 HIV 治疗的靶标[38]。

5.3 酪氨酸激酶抑制剂

酪氨酸激酶抑制剂（the tyrosine kinase inhibitors，TKIs）是一类新型的抗癌药物，能通过与几种致癌酪氨酸激酶的催化结构域竞争 ATP结合位点起作用。疏水性的TKIs能与ATP 依赖的主动转运蛋白如 BCRP 相互作用，有效地影响药物在体内的代谢。gleevec（imatinib mesylate，STI-571）和CI1033作为TKIs能够逆转 BCRP 介导的对喜树碱类如拓扑替康的耐药作用[39]。OSI-930 类似物 VKJP1和VKJP3 通过直接与BCRP的底物结合位点相互作用从而特异性抑制 BCRP的功能[40]。Dohse等[41]证明伊马替尼、尼洛替尼和达沙替尼这三种TKIs 都是 ABC 转运蛋白ABCB1和BCRP的转运底物，但是在较高浓度下可克服转运蛋白的功能。治疗剂量的伊马替尼和尼洛替尼具有可以削弱 ABCB1和BCRP 限制口服吸收或产生耐药性的潜能，但还需要更多的临床数据来证实。在BCRP 高表达的膜囊泡或细胞中，尼洛替尼能抑制 BCRP 对甲氨蝶呤（MTX）和米托蒽醌（MRX）的转运[42]。

5.4 BCRP的黄酮类化合物及其衍生物抑制剂

天然黄酮及其衍生物作为第三代 P-gp和MRP1 抑制剂的研究已有较多报道，并且与BCRP 有较高的亲和力，在克服 BCRP 介导的肿瘤细胞耐药性方面具有显著效果，能增加特定抗肿瘤剂的细胞毒性，如染料木黄酮、柚配基、金合欢素和山奈酚等可加强 7-乙基-10-羟基喜树碱和盐酸米托蒽醌对 BCRP 诱导产生耐药的K562 细胞的细胞毒性。槲皮素可以加强他莫西芬的抗肿瘤效应，与阿霉素（doxorubicine）合用可降低耐药细胞 P-gp的数量[43]。Katayama等[44]筛选得到了 32 种黄酮类化合物并研究其对 BCRP的抑制活性，结果发现许多黄酮化合物只能选择性抑制 BCRP 活性，而对 P-gp 以及MRP1 几乎不具有抑制作用。其中化合物 3',4',7-三甲基黄酮对 BCRP 显示了很强的抑制活性，它对 SN-38和MXR的RI50分别为0.012和0.044 μmol/L。水飞蓟素、橙皮素、槲皮素和大豆苷元等能直接与BCRP 相互作用，并调节其转运功能和ATP 活性，从而增加细胞内米托蒽醌的积累[45]。美国国立癌症研究所（NCI）运用高通量筛选方法从天然产物提取物资源库进行筛选，结果显示有 8 种热带植物提取物能显著地抑制 BCRP的功能[46]。Merino等[47]的研究结果表明，大豆异黄酮、染料木黄酮和大豆苷元通过对 BCRP1的抑制显著减少了排泄至乳汁中的呋喃妥英，而 BCRP/ABCG2在药物外排和药物转运至乳汁过程中所起的作用已被证实。

目前研究仅限于分析某一种黄酮化合物在蛋白质水平对 BCRP 表达的影响及对细胞内药物聚集浓度的影响，由于蛋白质水平不能完全反映 BCRP 介导的耐药性机制，有必要从 mRNA 水平分析黄酮化合物对 BCRP的表达影响，以及在耐药细胞株中 BCRP的表达差异与增加药物敏感性的关系，据此优化活性显著的结构单元，这对设计更好靶向 BCRP的抑制剂是至关重要的。许多临床研究表明，BCRP 抑制剂与治疗药物联合使用是保证药物有效性的一条有效策略。因此，我们研究小组通过借鉴传统中医中药配伍原则，进行不同结构类型黄酮苷衍生物组合配伍逆转BCRP 介导的多药耐药性的探索，发挥协同增效、多靶点增加肿瘤细胞对药物的敏感性。

6 BCRP 对干细胞增殖和分化的影响

越来越多的研究表明 BCRP 广泛表达于干细胞中，并获得了众多研究者的关注，积极探索它在干细胞发育生物学中的潜在作用。SP 表型是指肿瘤干细胞具有转运荧光染料Hoechst 33342的能力。研究发现 BCRP 参与SP 表型形成，Zhou等[3]首先发现 BCRP1/ABCG2 基因是一种SP 表型的决定因素，可作为多种肿瘤干细胞的标记物。BCRP 富集于各种非造血和造血组织的干细胞或祖细胞中。Ahmed等[48]发现 BCRP 在造血祖细胞中高表达而沉默于分化了的造血细胞中，这一结果表明 BCRP 在早期造血中发挥了作用。Martin等[49]研究表明在细胞分化时期，SP 干细胞中BCRP的表达显著下降。

BCRP 选择性表达表明其可作为未分化 HuES 细胞的标记物。此外，保护胚胎干细胞抵抗外源性和内源性化合物取决于BCRP的表达和调节[50]。在胶质瘤干细胞中检测到BCRP的表达，而且 BCRP的表达水平与胶质瘤的发展成正相关，这说明 BCRP 可能是黑素瘤发展的标志物[51]。Chen等[52]基于一种RNA 干扰方法发现 BCRP的抑制能有效阻止癌细胞的增殖。由于在干细胞中的保守表达，BCRP可能可以作为一种普遍的标志物区别不同组织的干细胞。

另外，BCRP 在加速增殖和阻断干细胞分化中起着特殊效果，这揭示了在干细胞基础治疗中的一种潜在应用。此外，BCRP 作为一种已知的干细胞和祖细胞的标记物，在缺氧条件下能够增强细胞的生存优势[53]。因此，随着对 BCRP的更深入研究将会为干细胞和癌症治疗开辟一条新的道路。

7 展望

BCRP 作为ABC 超家族 G 家族的新成员，由于其特殊的结构以及重要生化特性和生理功能，尤其在肿瘤的发生、诊断、治疗中潜在的应用前景而越来越受到人们的关注，成为ABC 转运蛋白结构与功能及其与多药耐药性相关研究的重要热点之一。近 10 多年来，对 BCRP 转运蛋白的生理功能、转运机制、临床耐药机制及其耐药逆转的研究虽然取得了一定进展，但仍有待于进一步深入研究。

目前，对 BCRP 体内外功能研究方面已经取得了较大的进展，例如确认了越来越多的底物和抑制剂，以及BCRP对这些外源性或内源性底物在吸收、排泄、分布等方面发挥的重要作用。BCRP 不仅广泛分布于人的多种正常组织中，是血脑屏障、胎盘屏障、血睾屏障等重要生理屏障的组成部分，同时也高表达于某些血液肿瘤和固体瘤中。而 BCRP 在干细胞的侧群细胞中的保守表达为干细胞提供了一种保护功能，并可作为区分某些干细胞的标记物。因此，通过对正常细胞与肿瘤细胞中 BCRP 表达及功能差异点的研究，以寻求合适的作用于肿瘤细胞及肿瘤干细胞的药物靶点，可能会成为肿瘤治疗的新的研究方向。此外，BCRP具有促进干细胞的增殖及阻止其分化等特殊作用，这也揭示了 BCRP在干细胞治疗方面具有潜在的应用前景[54]。

虽然人们早已意识到 BCRP 在肿瘤细胞多药耐药性中发挥重要作用，但是通过使用 BCRP的抑制剂避免癌症患者对临床药物耐药性的治疗方法还未实现。这就需要进一步开发高抑制效能、高特异性、低毒的BCRP 抑制剂以及合理设计临床试验。此外，我们认为需要更加深入全面地了解BCRP的作用机制。例如 BCRP 如何识别底物以及其拥有广谱特异性底物的决定因素？如何转运底物以及在底物转运过程中如何与ATP的水解相偶联？BCRP 最小的功能单位是同源二聚体还是其他低聚物？对这些问题的答案仍未清楚，迫切需要进行进一步研究解决这些问题[16]。此外，高分辨 BCRP 三维结构的缺少使得对 BCRP转运分子机制的认识难度大大增加。

相信新的实验技术方法的应用、药物基因组学的发展、新突变位点的发现，必将有助于进一步阐明 BCRP 转运蛋白的生理功能及其转运机制。

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