耳蜗谷氨酸循环在听力损伤机制中的研究进展△

赖玉婷 梁琴

·综 述·

耳蜗谷氨酸循环在听力损伤机制中的研究进展△

赖玉婷 梁琴

谷氨酸是人和哺乳动物耳蜗突触的主要神经递质。耳蜗内存在谷氨酸循环，既保证有足量的谷氨酸来完成信息的传递，又避免谷氨酸在耳蜗传入突触间隙积聚。当谷氨酸循环出现障碍，过量的谷氨酸积聚在突触间隙，将产生兴奋性毒性导致听力损伤。本文主要综述耳蜗谷氨酸循环的生理过程以及其兴奋性毒性在听力损伤机制中的新进展。

耳蜗内毛细胞与I型螺旋神经构成传入性突触，其主要的神经递质是谷氨酸。内淋巴液的机械刺激激活内毛细胞膜上的钙通道引发Ca2+内流，促使内毛细胞向突触间隙释放神经递质。突触间隙内的谷氨酸与突触后膜上的谷氨酸受体相互作用，使细胞膜去极化，由此，来自内淋巴液的机械刺激转变为传入神经元上的电位变化。毛细胞周围支持细胞上的谷氨酸-天冬氨酸转运体能将突触间隙过量的谷氨酸转运进入支持细胞，在谷氨酸合成酶的作用下合成谷氨酰胺，维持突触间隙内谷氨酸的平衡。这就是哺乳动物耳蜗内的谷氨酸循环通路。若突触间隙谷氨酸积聚，将产生兴奋性神经毒性，导致听力损伤。

1 耳蜗谷氨酸循环过程

1.1 谷氨酸的释放 内毛细胞上的钙通道持续性激活使突触前膜持续并且具有差异性地释放神经递质，从而完成对声音的编码。内毛细胞膜上的钙通道主要是具有电压门控性L-型钙通道Cav1.3，对二氢吡啶敏感。缺乏Cav1.3将使内毛细胞失去90％的Ca2+流入，显著减少细胞神经递质的释放；敲除Cav1.3将导致耳聋，表现为对听觉刺激缺乏反应以及听性脑干反应（auditory brain stem response，ABR）阈值升高［1］。几乎所有兴奋性细胞上的钙通道都具有Ca2+依赖性失活的特点，但随着Ca2+的内流，内毛细胞上的钙通道并未出现明显的失活。有实验证明毛细胞上的钙结合蛋白（CaBPs）具有阻断这种Ca2+依赖性失活的作用，从而使得通道持续性开放；另外一种可能是，毛细胞表达钙依赖性失活基因的剪切体，可以去除该基因，从而避免毛细胞膜上钙通道出现Ca2+依赖性失活。肯定的是，即使在静息状态下，毛细胞膜上的钙通道也具有开放的可能［2］。

神经递质是由内毛细胞带状突触释放。带状突触为脊椎动物所特有，是毛细胞突触侧呈带状的结构，在电子显微图中具有电子致密、嗜锇性特点，周围环绕着囊泡。对带状突触进行酶解提示带状突触是由蛋白质构成，用单克隆抗体B16标记带状突触呈阳性。Zanazzi等［3］证实RIBEYE是带状突触的主要成分，且RIBEYE只存在于带状突触。至少有五大家族的细胞基质蛋白在带状突触周围集聚，组成纤维网络，使含有神经递质的囊泡聚集在此区域，并且相互之间紧密联系。这些细胞基质蛋白包括Liprins，RIMs，Munc13s，CASTs/ERCs/ELKS，Piccolo和Bassoon。除Liprins外的4种细胞基质蛋白都在带状突触周围密集，其中RIM1是最先发现集聚在带状突触周围的细胞基质蛋白［4］。在普通的突触中，RIMs与Munc13s相互作用促进囊泡的融合，但在带状突触中RIMs功能仍然未知。由于在带状突触中也存在Munc13s，很可能在带状突触中RIMs与Munc13s具有相似的功能，而其余的细胞基质蛋白可能起着辅助的作用［5］。

毛细胞内的Ca2+感受器为突触结合蛋白Ⅳ或者耳畸蛋白。毛细胞感受到Ca2+信号后以多囊泡的形式释放神经递质。这些囊泡释放过程相互联系协调，递质释放入突触间隙后可以激发不同幅度的单个兴奋性突触后电位［6］。在蜗轴区，内毛细胞蜗轴面以及基底面的带状突触更大，但相应的a-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸（AMPA）受体区域却更小。由此导致了同一内毛细细胞不同方位对应神经纤维的敏感性和自发性放电比率的差异［7］。

1.2 谷氨酸与谷氨酸受体作用 传入突触后膜上存在谷氨酸受体。谷氨酸进入突触间隙后，将与这些受体结合，使I型螺旋神经元膜电位变化，产生听觉信号并向上级神经元传递。

谷氨酸受体分为配体门控离子通道的离子型受体（iGluR）和G蛋白耦联的代谢型受体（mGluR）。离子型受体主要分布于细胞膜上，介导快信号传递，作为兴奋性神经递质的谷氨酸主要作用于离子型受体；代谢型受体主要分布于细胞质，介导慢信号传递，通过与G蛋白耦联来调节第二信使的代谢。

离子型受体分为NMDA受体和非NMDA受体，NMDA受体包括NR1和NR2亚型，非NMDA受体主要是Kainate型受体、delta型受体和AMPA受体，AMPA包括GLuR1-GLuR4。其中AMPA受体及KA受体与Na+通道耦合，NMDA受体与电压依赖型Ca2+通道耦联。

耳蜗内Ⅰ型毛细胞与螺旋神经元构成的传入突触中，起到传入听觉信息的突触后受体尚有争议。有学者［8］认为NMDA受体和AMPA受体同时存在于传入突触中，其中谷氨酸主要作用于AMPA受体，传递听觉信息。也有学者通过鼓阶向小鼠耳蜗注入对KA受体具有高选择性的拮抗剂后，小鼠的CAP降低，听阈提高，但DPOAE未受到影响。因此认为在耳蜗突触中，AMPA和KA受体同时起作用，完成信号的传递［9］。Chen等［10-11］发现在听觉过度刺激后，位于螺旋神经元膜上的AMPA受体表达发生可逆性下降，并且认为这是螺旋神经元的一种自我保护性反应，避免听觉神经元发生谷氨酸兴奋性毒性反应。这提示，在听觉信息的传递过程中，AMPA受体起主要作用。

1.3 谷氨酸的清除 内毛细胞周围的支持细胞膜上具有谷氨酸-天冬氨酸转运体（GLAST）。当毛细胞与Ⅰ型神经元构成的传入突触间隙内谷氨酸过量时，GLAST将过多的谷氨酸转运入细胞内，在谷氨酸合成酶的作用下合成谷氨酰胺，从而维持突触间隙谷氨酸的平衡［12］。从蜗顶向蜗底，支持细胞上GLAST密度逐渐升高，在距离蜗顶6～9 mm区域达到峰值，然后逐渐降低，并且内毛细胞柱细胞侧GLAST的总量多于中轴侧［13］。在耳蜗螺旋韧带和螺旋边缘的纤维细胞上也存在GLAST。体外实验证实，D-天冬氨酸在表达GLAST的耳蜗螺旋韧带和螺旋边缘的纤维细胞中累积，并且诱发出可以被GLAST阻滞剂TBOA阻断的电流，这与内毛细胞周围的支持细胞类似。

2 耳蜗谷氨酸循环障碍所致疾病

当耳蜗谷氨酸循环出现障碍，突触间隙谷氨酸积聚，将过度激活突触后膜上的谷氨酸受体。AMPA受体被过度激活时，引起Na+大量内流，继而Cl-和水分子被动内流，使耳蜗传入神经纤维发生水肿甚至死亡。NMDA受体直接与Ca2+通道耦合，NMDA受体被过度激活将造成耳蜗传入神经Ca2+超载，继而产生胞内渗透压失衡以及细胞毒性损伤，引起突触后神经纤维肿胀，甚至变性、凋亡。

Steinbach等［14］认为谷氨酸的毒性所致螺旋神经元病理性变化和数量的减少主要与谷氨酸诱发神经元的凋亡有关，并且证实了运用caspase-3阻滞剂可以阻断谷氨酸的毒性。对出生后6 d的大鼠耳蜗组织块体外培养，在保证完整的传入突触结构的前提下，对NMDA和KA受体进行处理，使传入突触减少及Ⅰ型螺旋神经元轴突末梢变性，模仿兴奋性毒性对传入突触的损伤，但研究发现，这种情况下，毛细胞内带状突触并没有明显的改变［15］。

2.1 噪音损伤性疾病 过度的听觉刺激将使内毛细胞释放过多的谷氨酸，导致Ⅰ型螺旋神经元轴突末梢损伤。在噪音背景下，使用谷氨酸拮抗剂犬尿氨酸，可以减少神经元的损伤保护听力。由此说明，耳蜗谷氨酸兴奋性毒性是导致噪音性听力损伤的原因之一。噪音性听力损伤的具体机制仍不清楚，除了谷氨酸的兴奋性毒性外，有研究认为听觉过度刺激时，耳蜗内氧化应激产物增多也可以导致噪音性听力下降。近年来，越来越多的研究关注如何在噪音环境中使听力得到保护。Duan等［16］使用卡洛维林（耳蜗谷氨酸受体AMPA和NMDA的拮抗剂，也是抗氧化剂），可以明显地保护耳蜗，抵抗噪音刺激性损伤。Murashita等发现蝇蕈醇（muscimol），一种GABAA兴奋剂，在声音过度刺激之前向小鼠腹腔注射，可以观察到蝇蕈醇明显降低了小鼠的ABR阈值，并且阻断了由听觉暴露导致的传入神经末梢的肿胀［17］。Graham等［18］发现促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）受体CRF1和CRF2在鼠类动物的耳蜗中表达，并且证实缺乏CFR2的小鼠比野生型小鼠具有更低的听力阈值，但这使得小鼠对听力损伤更为易感。

2.2 缺血缺氧性损伤 耳蜗缺血时将释放大量的谷氨酸［19-20］，并且观察到CAP的消失，这说明耳蜗缺血后听力的改变可能跟谷氨酸兴奋性毒性有关。也有研究［21］认为，耳蜗缺血所致的细胞外增多的谷氨酸主要引起AMPA/kainate型谷氨酸受体的大量激活，引发听觉神经元末梢的变性和听觉的损伤。有学者［22］发现耳蜗在缺血损伤后毛细胞消失，说明耳蜗缺血后谷氨酸毒性作用既损伤突触后神经元，也对损伤突触前的毛细胞。Tabuchi等［23］则认为在耳蜗缺血时，谷氨酸的兴奋性毒性加剧了初级听觉神经元的损伤，而耳蜗在缺血后再灌注时所释放的氢氧自由基和NO将进一步加重耳蜗的损伤。Fujiwara等［24］在耳蜗应用合成的人类胰岛素样生长因子（rh IGF1），可以显著减缓缺血后耳蜗的ABR水平上升，提示rh IGF1可以在耳蜗缺血过程中起到保护作用。

2.3 梅尼埃病 梅尼埃病是一种特发性膜迷路积水的内耳病，表现为反复发作的旋转性眩晕，波动性感音神经性听力损失，耳鸣和（或）耳胀满感。目前普遍认为，其基本的组织病理变化与内耳膜迷路积水相关。但是膜迷路积水所致内毛细胞和螺旋神经元减少的程度和听力下降的程度并不一致，且螺旋神经元的丢失要多于内毛细胞的丢失，这提示膜迷路积水时耳蜗的损伤可能主要是螺旋神经元的损伤。Megerian等［25］发现豚鼠积水模型积水侧耳蜗神经和第Ⅷ对脑神经的直径明显减小，推测积水导致的内耳损伤是神经毒性的一种表现形式，主要是螺旋神经元神经纤维的退变，并且神经纤维的变性程度并不依赖于积水的严重程度。Anne等［26］在通过PCR技术发现，豚鼠积水模型中耳蜗谷氨酸转运体、一氧化氮合酶以及Caspase3的mRNA表达水平明显提高。这提示内淋巴积水病理状态下可能引发了谷氨酸释放增多，甚至达到毒性水平。Sami等通过实验证实谷氨酸释放阻滞剂，可以对内淋巴积水相关的听力下降起到保护作用或者延缓听力退变的进展速度［27，28］。以上研究表明，膜迷路积水引发螺旋神经元的损伤可能是积水的慢性刺激导致谷氨酸兴奋性毒性反应，引发螺旋神经元及其他细胞内一系列生物化学的变化，比如反应性氧化产物的激活以及caspase3依赖和非依赖性的凋亡途径的激活，最终导致了神经元退变或者死亡［29］。

临床上出现的噪音性、缺血缺氧性听力损伤以及梅尼埃病都与谷氨酸的兴奋性毒性有关。目前对这些疾病的研究集中于谷氨酸对突触后膜的作用以及谷氨酸的清除。对谷氨酸的生成和释放进一步研究有助于更全面认识听力损伤疾病的发生与发展。

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2012-12-04）

（本文编辑 杨美琴）

上海市科委自然基金项目（10ZR1405800）

复旦大学附属眼耳鼻喉科医院耳鼻喉科 上海 200031

梁琴（Email：lqeent＠126.com）