水果中有机酸的分析方法研究进展

王天玉 张伟清 陈伟

（浙江省柑橘研究所 台州黄岩318026）

水果中有机酸的分析方法研究进展

王天玉 张伟清 陈伟

（浙江省柑橘研究所 台州黄岩318026）

水果中常见的有机酸有柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乙酸、丁二酸和草酸等，是果实中主要的风味营养物质，可软化血管，促进钙、铁元素的吸收，能刺激消化腺的分泌活动，有增进食欲、帮助消化吸收及止渴解暑的功能，是果品成熟度、储藏性以及加工性的重要依据，其种类和含量与果品品质有密切关系，因此研究水果中有机酸的组成和含量，在果品品质鉴定中占有重要地位[1,2]。由于有机酸种类较多，易溶于水或乙醇，难溶于其它的有机溶剂。目前，关于有机酸的提取和检测方法较多，有水提取法[3～4]、衍生化法[5]、滴定法[6～7]、分光光度法[8]、GC[9～10]、HPLC/HPLC-MS[11～14]等，通过对这些方法的总结和对比，可更好的为不同水果中有机酸的分析方法研究提供参考依据。

1 样品前处理方法

1.1 提取方法

有机酸主要是含有羧基(-COOH)、磺酸(-SO3H)、亚磺酸(RSOOH)、硫羧酸(RCOSH)等一类的化合物，与水和强极性的溶剂有很好的溶解性，因此，大多数采用水和醇类提取。刘文静等[15]称取一定量的杨梅匀浆基质，加入蒸馏水旋涡振荡2min，超声提取15min处理；郭根和等[2]在枇杷果肉的匀浆液中加入一定量 0.04moL· L-1KHPO-HPO，pH为

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2.4 的缓冲液，75℃水浴加热浸提45min，冷却至室温，旋涡振荡2min，超声提取15min，过滤；庞新安等[3]对巴旦杏、无花果、沙枣、石榴采用80%乙醇匀浆提取 5min处理，均取得较好的回收率；沈宏等[16]将番茄匀浆，加入适量的蒸馏水，在75℃水浴中提取15min；王瑞琪等[17]在烟草粉末中加入蒸馏水，压力为10.3Mpa，温度60℃，静态时间6min，冲洗体积150%，吹扫时间100 s，静态循环 1次的条件下加速溶剂萃取其中的有机酸。

1.2 净化方法

对于不同的样品要采取不同的净化方法。目前使用最多的净化方法为液液萃取和固相萃取两种。郭燕等在测定苹果中有机酸的过程中，经过蒸馏水超声提取后，在10000r/min离心15min和过C18固相萃取小柱(先用2mL甲醇活化，再用5mL水洗去甲醇)，取 5mL试液，以10mL/min流速通过预活化的固相萃取小柱，弃去初始的 2mL滤液，收集后续 3mL滤液，用0.45 μ m滤膜过滤[4,18]，均有较好的回收率；高芸等[5]有机酸衍生化反应后通过二氯甲烷液液分配净化后，采用气相色谱测定；藏祥韵等[19]将水果中的有机酸经过乙醇提取后，滤液通过DEAE纤维素交换柱(柱长20cm、内径 1cm装约15mL的DEAE纤维素)，先用50mL无离子水洗去糖分及其它杂质，再用70mL 0.1N Na2SO4溶液洗脱有机酸。

1.3 衍生化方法

有机酸难溶于有机溶剂，具有一定的酸性，为了能够用于气相色谱检测，需要发生衍生化反应，生成沸点低，易于气化的酯化

物质，但存在方法比较繁琐，反应过程不充分等问题。曾有报道，猕猴桃样品提取液中加入10%H2SO4-CH3OH溶液，低速机械振荡30min，放置过夜进行衍生化反应[5,20]；杜曦等[21]测定了葡萄酒中的多元有机酸，样品于蒸发皿中，用0.1mol/L的四甲基氢氧化铵中和至pH为8，水浴蒸干，冷至室温，以N,N-二甲基甲酰胺分次溶解剩余有机酸盐，溶液转移入试管中，逐滴加入一定量碘乙烷，紧塞，摇匀，放置30min后在选定实验条件下进样分析。

2 测定方法

2.1 液相色谱(HPLC))方法

由于有机酸易溶于水，一般选择液相色谱法进行检测。有机酸大多数都有紫外吸收，故选用紫外检测器，同时该类化合物在C18柱上面都能取得较好的分离效果，选取不同的流动相可以满足不同的需求。刘文静[15]等对杨梅果实中的10种有机酸进行液相色谱测定，流动相：0.04mol/L KH2PO4-H3PO4缓冲液，pH值2.4；流速：0.8mL/min；柱温：35℃；进样量10uL；检测波长：214nm，得到有效分离；黄桂颖等[22]测定了荔枝肉中草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、富马酸、柠檬酸、琥珀酸10种有机酸，采用0.01mol/L（NH4）2HPO4（pH 3.0）溶液作为流动相，流速为1.00mL/ min，检测波长为213nm；陈向明等在流动相为3%甲醇- 0.01mol/L K2HPO4溶液，用磷酸调节 pH为2.0，流速为0.5mL/min，进检测波长为210nm的条件下测定银杏果中7种有机酸的含量，检出限在 0.001～ 0.067 μg/mL之间；另外一种采用离子排斥色谱法测定水果中的有机酸，其为高容量的树脂，电离组分受排斥不被保留，而弱酸则有一定保留的原理，即分离机理为离子排斥。郭燕等[4]采用光电二极管阵列检测器测定苹果中柠檬酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等几种有机酸，检测波长为210nm，流动相为0.01mol/L H2SO4溶液，流速为 0.5mL/min，色谱柱为ICPAKTMION Exclusion(WAT010290)，取得较好的分析效果；郭德华等[23]采用离子排斥色谱法同时测定果汁中11种有机酸，流动相也为 H2SO4。

2.2 液相色谱-质谱联用(LC-MS))分析法

液相色谱-质谱联机是使用合适的接口技术将液相色谱和质谱仪联结起来的一种大型仪器，不仅检测灵敏度高、选择性好，并且可以定性、定量检测同时进行，对于初级监测呈阳性反映的样品进行在线确证，优势十分明显。

王乃平等采用液质联用法测定广山楂有机酸含量色谱柱为Kinetex HILIC100 A ( 4.60 mm×100 mm，2.6 μm)，流动相为乙腈-乙酸铵水溶液(30∶70)，流速0.5mL/min，进样量 0.5 μ L，质谱条件为ESI离子源，检测方式为MRM多重反应监测，负离子模式，干燥气温度35℃，雾化器压力40Psi，干燥气流速10L/min，扫描方式选择离子监测(SIM)，结果显示，苹果酸、柠檬酸、酒石酸 3种有机酸回收率分别为103.07%(RSD 3.85%)，99.51% (RSD 4.12%)，85.03%(RSD 4.39%)。

2.3 气相色谱（GC）方法

气相色谱法(GC法)是采用气体作流动相，待测组分通过色谱柱，利用物质在两相中的反复分配，最后实现组分的分离和检测，它分析的对象是气体以及可挥发的物质。常用的色谱柱有填充柱、毛细管柱两大类，检测器一般有ECD、FPD、FID、NPD、TCD等。

对于有机酸酯化后的衍生物，其中主要集中在FID的检测[5,21,24]，高芸等对猕猴桃中的有机酸进行衍生化后，采用气相色谱法测定，在DB- 5毛细管柱，进样口温度250℃，检测器温度280℃，升温程序：初始温度40℃，保持 2min，以8℃/min升至250℃，保持 6min的色谱条件下取得良好的分离和较高的回收率。

2.4 气相色谱-质谱联用(GC-MS))分析法

GC-MS联用仪分析农药最初是以电子轰击离子定性，选择离子检测定量开始的，当高灵敏度的离子阱质谱仪出现以后，GC-CI-MS方法已成为农药残留分析的常规手段。气质联用技术既发挥了色谱法的高分离能力，又发挥了质谱法的高鉴别能力，尤其适用于多残留分析，现已经成为一种相对成熟的检测手段。

目前对于有机酸的检测大多采用EI源[20,25]，如梁茂雨等采用此方法测定红提葡萄中有机酸，样品经过硫酸甲醇酯化后，选取弹性石英毛细管柱HP-Innowax，程序升温：初温 50℃，保持2min，以4℃/min升至220℃，保持15min。 进样口温度250℃，进样量1.0 μ L，分流比10∶1，氦气流速1mL/ min；EI源电子能量70Ev,电子倍增器电压1600 V，质量扫描范围30AMU～550 AMU，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，可测得17种有机酸。

3 结语

果实中有机酸是决定果实风味品质的重要因素之一。对有机酸成分检测技术的不断更新能够更好地为有机酸在水果中的调控提供更准确的数据，它在果实自身代谢中参与了光合作用、呼吸作用，以及合成酚类、氨基酸、酯类和芳香物质的代谢过程。通过有机酸成分检测方法的分析和评述，为有机酸方面的研究提供更好的依据。

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