结核病耐药性检测技术进展及存在的问题和对策

胡忠义

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结核病耐药性检测技术进展及存在的问题和对策

胡忠义

结核病耐药性检测技术研究取得了显著进展,但仍不能满足临床诊治及防控的需求。一些新的细菌学和分子生物学药敏检测技术尽管比传统的耐药性检测方法更加快速和灵敏,但是各种新技术在临床应用中也存在着不少问题。就这些新技术的优缺点及可能解决的措施和进展情况提出了一些看法,以便促进这些新技术的推广和应用。

结核； 抗药性,细菌； 微生物敏感性试验

结核病耐药性检测技术研究虽然经过数十年的努力,取得了显著进展,但仍不能满足临床诊治的需要［1-2］。笔者就近年来的一些耐药性测定新技术、新方法进展情况及其在应用中存在的问题和可能解决的方法提出一些看法,力图促进这些新技术的推广应用。

理想的耐药性检测新技术要求

理想的耐药性检测新技术应该达到以下四个基本要求。

1.快速：总体是越快越好。分子药敏技术应该当天获得结果,细菌学药敏检测希望在1周左右时间获得结果。

2.准确：准确性越高越好。其中敏感度应该不低于90%,特异度应该在95%以上。

3.简便：操作简便,步骤少,减少人为因素影响,能够自动化或半自动化更好。

4.价廉：价格低廉,便于基层民众承受。

当前常用耐药性测定方法存在的问题

一、细菌学耐药性测定方法

1.固体药敏培养法：绝对浓度法和比例法是目前国内外普遍应用的结核病耐药性测定方法。其主要问题是：需时久,4周才能获得结果；准确性低,与临床符合率差；操作繁琐,传播风险大。

2.液体药敏培养法：MGIT-960是国际公认的液体培养耐药性检测方法,具有快速、准确、仪器化检测等优点,但需特殊仪器设备,试剂依赖进口,费用昂贵,限制了其在基层单位的应用。

二、分子药敏检测

分子药敏检测在我国尚处于研究阶段,极少数单位开展临床应用研究,其临床意义难以定论。

耐药性检测新技术及其存在的问题

一、细菌学药敏检测技术及其存在的问题

1.细胞培养板药敏检测技术：该法在25孔细胞培养板上进行固体药敏最小抑菌浓度（MIC）测定,7～10 d可获得药敏结果,具有简便快速的优点［3］,但是由于含药培养基用量少,分装制备较为繁琐,需依赖专用仪器设备,而且所用的MiddleBrook 7H10琼脂培养基价格较贵,影响了其在基层的推广应用。

2.液体微孔板MIC药敏检测：这种方法是在96孔塑料板上进行的微量液体药敏试验,7～10 d就可获得10余种抗结核药物的MIC测定结果。检测结果表明,本法简便快速,敏感度和特异度均可达90%左右,而且费用低廉,很受临床欢迎［4-5］。存在的问题是液体培养基质量直接影响药敏结果的时间,早期结果观察存在主观性,生物安全隐患较大。

3.显微镜观察直接药敏试验：该法是将液体培养药敏试验与倒置显微镜观察技术相结合的一种快速耐药性检测技术。由于 Mtb在液体培养基中生长时形成索状结构,可以在倒置显微镜下观察到。该法可同步进行痰标本的快速培养和药敏检测,7 d即可获得诊断和药敏结果,尤其是其药敏检测结果的准确性可达95%以上,深受临床用户欢迎［6-7］。存在的问题主要是液体培养基质量直接影响药敏结果的时间和准确性,早期结果观察时可能会出现人为因素的影响,质量控制较难。另外,每日镜下观察,生物安全隐患较大。

4.双相罗氏培养基药敏试验：是一种将固体罗氏培养基和液体药敏培养基结合为一的快速药敏检测技术,具有简便、准确、价廉、不需特殊仪器设备等优点；其药敏时间比常规罗氏药敏时间缩短2周,药敏结果与MGIT960的符合率达95%以上,而其成本仅为MGIT960的1/5,因此深受用户喜爱［8］。但是药敏早期结果肉眼不易观察,需要通过加入显色剂得以解决。

5.噬菌体扩增检测技术：该法2～3 d即可获得药敏检测结果,是目前最快的 Mtb表型药敏检测技术。具有准确、价廉、不需特殊仪器等优点［9-10］。除可用于临床分离株的耐药性检测,也可用于涂阳痰标本的耐药性测定。该法最显著的优势是生物安全性高,因其结果是将耐药菌株裂解。这对实验室生物安全和降低操作者被感染的风险具有重要意义。存在的问题是：操作步骤较多、容易污染和难以进行质量控制,这些都将影响其推广应用。

二、耐药性分子药敏检测新技术及其存在的问题

分子药敏检测技术近年来进展迅速,其最大优点是快速,通常1 d即可获得药敏结果,是WHO重点推荐的结核病快速药敏检测方法。

1.线性探针杂交药敏检测技术：将常见突变位点的寡核苷酸探针（R探针）和正常序列的探针（S探针）分别固定在硝酸纤维素膜上,与待检菌株PCR扩增产物杂交。然后加入显色系统,以呈色反应判定药敏试验结果。若扩增产物与S探针杂交阴性,与R探针杂交阳性,则待检菌株为耐药株,反之为敏感株。本法快速、灵敏、特异。已有产品上市,可同步检测利福平和异烟肼的耐药性。对比结果表明,本法对利福平耐药株的阳性检出率可达90%,对异烟肼耐药株的检出率达70%以上［11-12］。存在的问题是只能检出常见的突变位点,而且对异烟肼的耐药性检出率还需提高。同时价格昂贵也是重要问题之一。

2.Xpert Mtb/RIF：该技术是利用RFP耐药性相关基因rpoB特异性结合的分子信标（一种呈发夹结构的茎环双标记寡核苷酸探针）来检测Mtb的rpoB基因上的利福平耐药决定区有无突变。如果存在突变,则会影响分子信标与靶序列的杂交,使得荧光值下降,通过比较荧光信号的变化检测利福平的耐药性［13-14］。其最大优点是快速、灵敏,特异度高,但也存不少问题。最主要的是只能检测RFP一种药物的耐药性,敏感度达90%左右。另外,需要特殊仪器设备,试剂费用也较贵,限制了其在基层的推广应用。

3.基因芯片药敏检测技术：该法快速,从样品制备到检测结果只需4 h；灵敏,可以达微克、微微克水平。目前国内已开发的产品可同步进行Mtb和10多种常见非结核分枝杆菌的菌种鉴定,检测 Mtb对4种一线抗结核药物的耐药性［15-16］。存在的问题是：只能检出常见的突变类型,同时操作要求很高,仪器试剂较贵,限制了其广泛应用。

4.测序：测序既能确定有无突变及突变部位和性质,因此是耐药性测定的金标准方法。方法有Sanger DNA测序和焦磷酸测序技术。该方法对于操作技术要求较高,且受较多因素影响。值得一提的是焦磷酸测序技术,研究显示：与常规药敏方法比较,该法的敏感度为96.7%,特异度为97.3%［17-18］。该技术是依靠生物发光进行的实时DNA测序分析技术,其操作简单、结果准确,且无需电泳和荧光标记,同时能提供精确的碱基序列信息。与Sanger法相比,焦磷酸测序技术测试速度快、成本低廉。由于该技术适用于对已知的较短DNA序列的测序分析,所以非常适合Mtb的耐药性检测。本法存在的主要问题是：操作繁琐,条件要求严格,要测的耐药基因种类很多,无效突变也被检出,而且需要昂贵的仪器设备,费用较贵。

结核病耐药性检测技术展望

结核病耐药性快速检测研究虽然已取得了一些进展,但仍不能满足临床诊治的需要。这主要与下述因素有关：首先是细菌药敏检测方法都是生长依赖性的,即只能对分离的菌株进行检测,因而仍需较长时间；其次是药敏结果的临床含义即细菌学耐药与临床耐药结果的一致性不确切；再者由于方法、原理及药物浓度上的差异,各方法间缺乏良好的可比性。另外快速测定大多需特殊的仪器设备,且费用较贵,难以普及应用。再者分子生物学检测方法在国内尚属研究阶段,许多问题还没得到解决,因此短期内难以用于临床。

一、当前结核病耐药性检测存在的主要问题

1.缺乏系统的方法学评价：虽然,目前报道的 Mtb耐药检测方法众多,但能通过系统、科学的方法学评价的方法、且真正可用于临床的方法仍然很少。

2.方法学之间的比较研究缺乏：各种方法学的符合度及综合比较情况不清。

3.检测药物种类不全面：大多数耐药性分子生物学检测方法仅针对利福平和异烟肼少数药物。

4.操作规范化和质量控制不够：操作人员缺乏规范化培训,水平参差不齐,实验场地、仪器设备相距离很大,质量控制体系不健全。

5.与耐药相关的基础研究不够深入：目前仍有许多药物的耐药机制不清,导致无法进行分子药敏检测。

6.缺乏耐药检测新技术的转化：导致基础研究成果不能及时进入临床应用。

二、当前耐药性测定亟待解决的问题

首先：科学评估已有测定技术,要做到科学、客观、公平、公正,筛选出适合我国国情的耐药性测定新技术,进而推广应用。

第二：要加强现有药物的抗结核作用筛查,尤其是进行广谱抗生素的抗结核作用筛查,以便为抗结核治疗提供依据。

第三：加强检验技能培训和实验场地建设。

第四：加强检验结果的质量控制工作,健全质控体系。

第五：研究新的耐药性测定技术,包括细菌学、免疫学和分子生物学药敏检测技术,尤其是要开展RNA分子药敏检测技术研究,开展耐药相关的新型分子靶标筛查,开展耐药相关差异蛋白检测,开展耐多药相关的酶学检测技术研究。

第六：促进已有研究成果的转化,将研究成功的检测新技术尽快试用于临床。

第七：加强抗结核新药的研究,包括西药、中药、化学合成药物等。

近年来,尽管耐多药结核病的实验室诊断取得了一些进展,但是还存在许多问题应予重视。需要从事结核病基础、临床和防控人员紧密协作,联手对存在的问题进行攻关。相信随着检测方法的先进性、试剂的标准化和操作的规范化,以及临床意义界定等问题的逐步解决,结核病耐药性的实验室检测技术必将取得更大进展！

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The progress and the existing problems and countermeasures of TB drug resistance testing technolog

y
HU Zhong-yi. Shanghai Key Laboratory of Tuberculosis,Shanghai Pulmonary Hospital,Tongji University School of Medicine,Shanghai 200433,China

HU Zhong-yi,Email：shtblab@163.com

TB drug resistance testing technology research has made significant progress,but still cannot meet the needs of clinical diagnosis and treatment,and prevention and control.Some new drug susceptibility testing technology including molecular biology and bacteriology is more rapid and sensitive than the traditional detection method,but all kinds of new tools have some problems in clinical application.In this review,the advantages and disadvantages of these new technologies are presented and the potential countermeasures and the advancements are put forward,so as to improve the promotion and application of the new technologies.

Tuberculosis； Drug resistance,bacterial； Microbial sensitivity tests

2013-09-05）

（本文编辑：薛爱华）

“十二五”国家科技重大专项（2013ZX10003001）,上海市科委重点项目（12DZ2271100）

200433上海,同济大学附属上海市肺科医院上海市结核病（肺）重点实验室

胡忠义,Email：shtblab@163.com