胰腺高级别上皮内瘤变及其miRNA的研究进展

塔娜 郑建明

胰腺高级别上皮内瘤变及其miRNA的研究进展

塔娜 郑建明

胰腺上皮内瘤变(pancreatic intraepithelial neoplasia, PanIN)是指胰腺中小导管上皮细胞从不典型增生至原位癌这一系列病变的连续过程，根据其组织学异型性可分为3期，其中PanIN-1、2期为低级别，PanIN-3期为高级别[1-3]。目前已经证实PanIN-3期是胰腺癌最直接的癌前病变[4]。如果能在该期作出诊断，及时进行干预和治疗，是完全可以治愈胰腺癌的。因此寻找此期的特异性标志物是解决问题的关键。近年研究表明，miRNA不仅在肿瘤组织和细胞中的表达具有显著的肿瘤相关性、组织特异性和表达稳定性[5]，而且在外周血中的表达同样具有肿瘤相关性和组织特异性，与RNA比较，其表达稳定性更为显著，因此认为外周血miRNA可能是一种理想的肿瘤分子标志物。同样，胰液中miRNAs检测也是早期诊断胰腺疾病的重要途径[6]。因此，筛查和鉴定PanIN-3期组织和血或胰液中特异表达的miRNAs，探讨其作为胰腺癌早期诊断分子标志物的潜在可能性，对于提高胰腺癌的早期诊断率，改善其预后具有非常重要的意义。

一、胰腺上皮内瘤变(PanIN)

1．PanIN的病理特征和命名：PanIN是一种显微镜下才能观察到的胰腺中小导管上皮细胞出现的扁平或乳头状增生性病变，有一定程度异型性，属于非侵袭性病变。人类早在一个多世纪之前就已观察到此类病变，但由于缺乏统一的分类标准和命名，使用的术语各不相同。为了探讨胰腺导管病变新分级系统的科学性，1999年世界胰腺癌研究组将35例具有代表性的胰腺导管病变HE切片分别送给8位来自美国、加拿大和欧洲的病理学家，结果几乎每一例病理诊断都存在较大差异。为寻求统一，在后来的研讨会上病理学家们同意采用Klimstra和Longnecker等提出的“胰腺上皮内肿瘤”这一新概念和分级标准[7]。对照此标准，8位病理学家再一次复习原来的35例切片，并重新进行诊断，结果只有7例出现分歧，这一结果充分显示出新分级系统的科学性和实用性。在2003年召开的胰腺癌前病变会议就PanIN的组织学诊断和分级标准达成了国际共识[8]。

2．PanIN的临床特征：PanIN是只有在显微镜下才能观察到的病变，因此临床上是无症状的。PanIN可发生于各种胰腺病变中，甚至在正常胰腺组织中亦可出现，特别是低级别PanIN。但在慢性胰腺炎、胰腺导管内乳头状肿瘤、黏液性囊腺瘤和胰腺导管腺癌等病变中出现的频率较正常胰腺组织和其他胰腺良性病变中要高，特别是胰腺导管腺癌中，出现高级别PanIN的可能性要明显高于胰腺良性病变[9]。Andea等[10]研究显示，在慢性胰腺炎特别是胰腺癌癌周组织中经常可以见到胰腺上皮内肿瘤性病变，随访结果也显示PanIN，特别是高级别PanIN与胰腺癌的发生密切相关。笔者对250例不同胰腺组织中PanIN的发生率和分级进行了研究，结果显示PanIN的发生率为62.4%，从正常胰腺到慢性胰腺炎到胰腺导管腺癌组织中PanIN的发生率逐渐增加，尤其是高级别PanIN更为显著，PanIN-3期仅见于导管腺癌中[11]。

3．PanIN的分子遗传学改变：研究显示，随着PanIN级别的升高，构成其细胞的突变率随之增高，二者呈平行关系，高级别PanIN遗传学改变也在浸润癌中出现。Swaitz等[12]对PanIN和浸润癌进行黏蛋白4表达研究，发现浸润癌恒定表达黏蛋白4，而PanIN随着级别增加，黏蛋白4表达也随之增强。还有人对胰腺癌和PanIN的p53和DPC4基因进行研究，发现高级别PanIN和胰腺癌一样存在等位基因缺失。Feldmann等[13]通过检测正常胰腺导管和各级别PanIN性病变的基因改变，将胰腺癌的组织学进展与分子遗传学改变联系了起来。该模型显示从正常胰腺导管上皮发展到PanIN-3期伴有多种基因的改变和染色体的异常，早期有K-ras基因和Her-2/neu基因突变，中期有p16基因失活和染色体9p的杂合性缺失，而晚期则有p53、DPC4和BRCA2基因的异常和染色体6q、17p和18q的杂合性缺失。此外，目前PanIN中涉及的分子遗传学改变还包括端粒酶、黏蛋白、BRCA2基因、炎性细胞因子、miRNA和表观遗传学的改变等[14]。笔者通过建立PanIN和胰腺癌的组织芯片，对比研究了细胞增殖周期中多种相关基因改变和蛋白的表达，结果也显示出正常导管-低级别PanIN-高级别PanIN的演变过程[15]。

4．PanIN的动物模型：为了更好地研究PanIN发生、发展规律，探索胰腺癌早期诊断和有效治疗方法，最早的研究者采用化学诱导方法建立胰腺癌动物模型，如用亚硝胺类化合物或用偶氮丝氨酸诱导方法。此类模型的特点是制备方法简单、方便，但周期长，诱导成功率低，且诱导产生的肿瘤其病理形态学特征与人类肿瘤差别很大。后来人们通过接种在动物体内建立了人胰腺癌皮下或原位移植瘤模型，但这些模型只能用于特定的研究目的，如药物筛选或转移机制研究等。近年来，转基因动物模型的建立为获取胰腺癌早期病变样本提供了一条新途径[16]。Hingorani等[17]通过转基因小鼠成功进行了胰腺癌早期病变的造模，为早期胰腺癌标志物研究所需样本提供了来源。在该模型中，肿瘤稳定发生，研究者可以根据研究需要，获取不同阶段的肿瘤样本，已成为最经典的胰腺癌转基因小鼠模型。Ijichi等[18]建立的肿瘤模型的病理特征非常接近于人类胰腺导管腺癌(PDAC)。该模型PanIN的发生率更高，耗时更短，为开展PanIN-3期和早期胰腺癌分子标志物筛选创造了条件。Thayer等[19]建立的Pdx1-Cre-CLEG2-K-rasG12D模型更加接近于人类胰腺癌。此类采用“转基因可诱导表达系统”以K-ras转基因小鼠为基础诱导的多基因联合作用的转基因小鼠模型可成功诱导PanIN的发生，复制出人类胰腺癌的发生、发展过程，为胰腺癌的发病机制研究开辟了新途径。

二、胰腺上皮内瘤变中miRNA

miRNA是一种内源性非编码单链小分子RNA，长度19～24个核苷酸，通过与mRNA特定区域结合对蛋白质的翻译进行调控，在多种生物学过程中发挥重要作用。目前已报道1000多种人类miRNA，其中一部分miRNA在细胞增殖、凋亡和分化中发挥作用。多种肿瘤及癌前病变中存在miRNA表达谱的改变。

1．动物模型PanIN中miRNA研究进展：du Rieu等[20]研究了29例K-ras(G12D)突变小鼠胰腺腺管PanIN组织，发现miR-21、miR-205和miR-200在小鼠PanIN组织中表达增高，并用原位分子杂交技术证明在胰腺非典型增生的导管上皮细胞中miR-21的表达增高。LaConti等[21]通过建立基因工程胰腺癌小鼠模型(p48-Cre/LSL-KrasG12D)获取各级别PanINs进行差异miRNAs筛选。结果显示，与正常导管上皮相比，随PanIN级别升高而表达升高的miRNAs有miR-10、miR-16、miR-21、miR-100、miR-155，它们在高级别PanIN和癌组织中维持高表达，而降低的有miR-22、miR-148a/b、miR-212和miR-375。该研究还对这些差异表达的miRNA的靶基因进行了分析。Hanoun等[22]也在基因敲除小鼠LSL-KrasG12D/Pdx1-Cre+/-PanIN-1B、PanIN-2和PanIN-3中发现miR-148a明显下调，其原因是由于编码miR-148a的DNA甲基化所致。

2．人体组织PanIN中miRNA研究进展：Szafranska等[23]研究显示，60%的PanIN-3期中表达miR-196a，而PanIN-1期中不表达，提示miR-196a与胰腺癌发展有关。du Rieu等[20]通过显微切割方法获取人和胰腺癌小鼠PanIN组织，采用实时荧光定量PCR方法检测7种成熟miRNAs在PanIN中的表达，结果显示，miR-21随PanIN分级增加而上升，认为miR-21可作为胰腺癌早期诊断的分子标志物。但该研究没有筛查PanIN-3期存在的特异性miRNAs。Ryu等[24]分析了miR-21、miR-155和miR-221在胰腺PanIN-1、PanIN-2和PanlN-3期中的表达，结果显示miR-155在PanIN-2期表达上调，miR-21在PanlN-3期表达上调，提示miR-155表达异常出现在胰腺导管腺癌的较早期阶段，miR-155可作为胰腺癌前病变的生物学标记物。Yu等[25]采用激光显微切割方法获取人胰腺组织中的各级别PanIN病变和正常导管上皮，通过miRNA芯片筛查，鉴别出各级别PanINs中有107种miRNA存在异常表达，PanIN-3期中有35种表达异常，其中表达明显上调或下调(超过5倍以上)的miRNAs分别有20余种和10余种，上调表达的miRNAs有miR-106b-5p、miR-31-5p、miR-142、miR-101-3p、miR-29、miR-17-5p、miR-200b-3p、miR-195-5p、let-7g-5p、miR-93-5p、miR-21、miR-513b、miR-155、miR-4778-3p、miR-376a-5p、miR-3175、miR-146-5p、let-7a-5p、miR-1290、miR-34a-3p、miR-548a、miR-126-3p等；下调表达的miRNAs有miR-15a-5p、miR-125-3p3、miR-29c-3p、miR-16-5p、miR-218-3p、miR-127-3p7、miR-3122、miR-548、miR-126-3p、miR-3175、miR-217、miR-26a-5p、miR-150、miR-154-5p等；miR-196b是PanIN-3中特有的，认为它可以作为PanIN-3期诊断的分子标志物。

三、展望

miRNA在组织中不易降解，能够稳定地存在，且能够游离于细胞外，稳定存在于血浆或血清，具备疾病分子生物学标志物的特点，已在肿瘤诊断和预后评估中显示了独特的应用价值。但miRNA作为早期胰腺癌标志物的研究仍存在诸多问题，如通常在小样本研究中得到的PanIN相关miRNA表达谱能否作为生物学标志物尚需在大样本研究中得以验证；miRNA在胰腺癌发生及进展过程中发挥作用的分子机制尚有待进一步阐明；miRNA异常表达在胰腺癌发生、发展过程中出现和癌变的时间尚需进一步确定等。相信随着研究的不断深入和上述问题的阐明，将有助于加快miRNA作为早期胰腺癌，尤其是PanIN-3期生物学标志物由实验研究向临床应用转化的进程，为胰腺癌的早期诊断、预后评估和治疗提供新的分子靶标。

[1] Hruban RH, Adsay NV, Albores-Saavedra J, et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions.Am J Surg Pathol, 2001, 25:579-586.

[2] Sipos B, Frank S, Gress T, et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia revisited and updated. Pancreatology, 2009, 9:45-54.

[3] Cooper CL, O′Toole SA, Kench JG. Classification, morphology and molecular pathology of premalignant lesions of the pancreas.Pathology, 2013,45:286-304.

[4] Hruban RH, Maitra A, Kern SE, et al. Precursors to pancreatic cancer. Gastroenterol Clin North Am, 2007, 36:831-849.

[5] Chen YT, Kitabayashi N, Zhou XK, et al. MicroRNA analysis as a potential diagnostic tool for papillary thyroid carcinoma. Mod Pathol, 2008, 21: 1139-1146.

[6] Habbe N, Koorstra JB, Mendell JT, et al. MicroRNA miR-155 is a biomarker of early pancreatic neoplasia. Cancer Biol Ther, 2009, 8: 340-346.

[7] Hruban RH,Adsay NV,Albores-Saavedra J,et al.Pancreatic intraepithelial neoplasia: a new nomenclature and classification system for pancreatic duct lesions. Am J Surg Pathol, 2001, 25:579-586.

[8] Takaori K, Hruban RH, Maitra A,et al. Pancreatic intraepithelial neoplasia. Pancreas, 2004, 28: 257-262.

[9] Liszka L, Pajak J, Mrowiec S, et al. Precursor lesions of early onset pancreatic cancer. Virchows Arch, 2011, 458:439-451.

[10] Andea A, Sarkar F, Adsay VN. Clinicopathological correlates of pancreatic intraepithelial neoplasia: a comparative analysis of 82 cases with and 152 cases without pancreatic ductal adenocarcinoma. Mod Pathol, 2003, 16:996-1006.

[11] 郑建明，朱明华，林万和，等. 胰腺导管腺癌、慢性胰腺炎及正常胰腺组织中胰腺上皮内瘤变的比较研究. 胰腺病学, 2004, 4:150-153.

[12] Swartz MJ, Batra SK, Varshney GC, et al. MUC4 expression increases progressively in pancreatic intraepithelial neoplasia. Am J Clin Pathol, 2002, 117:791-796.

[13] Feldmann G, Beaty R, Hruban RH, et al. Molecular genetics of pancreatic intraepithelial neoplasia. J Hepatobiliary Pancreat Surg, 2007, 14: 224-232.

[14] Murphy SJ, Hart SN, Lima JF, et al. Genetic Alterations Associated With Progression From Pancreatic Intraepithelial Neoplasia to Invasive Pancreatic Tumor. Gastroenterology, 2013, 145:1098-1109.

[15] 郑建明，朱明华，倪灿荣，等. 胰腺上皮内瘤变和胰腺癌组织中TGF-β/Smads信号通路相关蛋白表达.临床与实验病理学杂志, 2005, 20:327-331.

[16] Guerra C,Barbacid M. Genetically engineered mouse models of pancreatic adenocarcinoma. Mol Oncol, 2013, 7:232-247.

[17] Hingorani SR, Petricoin EF, Maitra A, et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer Cell, 2003, 4:437-450.

[18] Ijichi H, Chytil A, Gorska AE,et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-beta signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev, 2006, 20:3147-3160.

[19] Thayer SP, di Magliano MP, Heiser PW, et al. Hedgehog is an early and late mediator of pancreatic cancer tumorigenesis. Nature, 2003, 425: 851-856.

[20] du Rieu MC, Torrisani J, Selves J, et al. MicroRNA-21 Is Induced Early in Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Precursor Lesions. Clin Chem, 2010, 56:603-612.

[21] LaConti JJ, Shivapurkar N, Preet A, et al. Tissue and serum microRNAs in the Kras(G12D) transgenic animal model and in patients with pancreatic cancer. PLoS One, 2011, 6:e20687.

[22] Hanoun N, Delpu Y, Suriawinata AA, et al. The silencing of microRNA 148a production by DNA hypermethylation is an early event in pancreatic carcinogenesis. Clin Chem, 2010, 56:1107-1118.

[23] Szafranska AE, Doleshal M, Edmunds HS, et al. Analysis of microRNAs in pancreatic fine-needle aspirates can classify benign and malignant tissues. Clin Chem, 2008, 54:1716-1724.

[24] Ryu JK, Hong SM, Karikari CA, et al. Aberrant MicroRNA-155 expression is an early event in the multistep progression of pancreatic adenocarcinoma. Pancreatology, 2010, 10:66-73.

[25] Yu J, Li A, Hong SM, et al. MicroRNA alterations of pancreatic intraepithelial neoplasias. Clin Cancer Res, 2012, 18:981-992.

2013-08-20)

(本文编辑：屠振兴)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2013.06.024

国家自然科学基金面上项目(81172077)

200433 上海，第二军医大学长海医院病理科

郑建明，Email: jmzheng1962@163.com