脂肪干细胞对创面愈合作用的研究进展

俞晓帆 综述 熊 猛 审校

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脂肪干细胞对创面愈合作用的研究进展

俞晓帆 综述 熊 猛 审校

创面愈合是由多种细胞及细胞因子参与的复杂过程，难愈或不愈创面是整形外科的一大挑战。随着人们对脂肪干细胞基础研究及临床应用研究的深入，利用脂肪干细胞来提高创面愈合已被证明是一种非常有前景的治疗策略。在此就脂肪干细胞促进创面愈合的机制、治疗策略的改进、细胞移植途径及临床应用研究等方面的进展进行综述。

脂肪干细胞创面愈合临床应用

创面愈合是一个复杂的病理生理过程，大体可分为炎症反应、肉芽组织形成、再上皮化及伤口愈合后塑形四个阶段，是一个多种细胞参与的有序变化过程。目前，难愈或不愈创面的治疗仍是整形外科的难题。利用组织工程技术，如干细胞疗法，来提高创面愈合速度成为近年来的研究热点。

脂肪干细胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）是由Zuk等[1]从脂肪组织中获取的多能干细胞，可向三个胚层的细胞分化，并可分泌多种细胞因子，如血管内皮生长因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、肝细胞生长因子（HGF）等。已有研究证实，脂肪干细胞具有促进上皮化、肉芽组织形成、血管重建等功能，对创面愈合具有积极作用[2]。

1 ADSCs促进创面愈合的机制

1.1 减轻炎症反应

炎症是机体对组织损伤或致病因子侵入的基本反应。其作用在于清除异物及自身伤亡的细胞、坏死组织，同时启动分泌多种细胞因子诱导修复细胞的迁徙、增殖。但炎症反应中激活和释放的炎症介质也可造成组织损伤，使创面愈合延期。董瑶等[3]将ADSCs注射入小鼠创面周围，检测到创面组织中促炎因子白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(TCP-1)表达下降，抗炎因子白细胞介素-10 (IL-10)表达上升，推测ADSCs促进皮肤创面的愈合机制可能与ADSCs降低创面局部的炎症反应相关。

1.2 促进肉芽组织沉积

成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分。在伤口愈合过程中，成纤维细胞可迁移到伤口，并通过有丝分裂大量增殖，合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损。

献报道ADSCs所分泌的细胞因子可加强成纤维细胞的增殖、迁移和分泌功能。Kim等[4]发现，ADSCs可通过细胞间直接接触或细胞因子的旁分泌激活作用，促进人成纤维细胞增殖；而ASC-CM可通过上调Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白、纤维连接蛋白和下调MMP-1 mRNA的表达，促进成纤维细胞分泌Ⅰ型胶原蛋白；在成纤维细胞的体外创伤模型中，发现ASC-CM可促进成纤维细胞向创面迁移。

Jung等[5]比较了TGF-β1与ASC-CM对创面愈合作用的异同。发现5 ng/mL TGF-β1组和50%ASC-CM组均可促进成纤维细胞中透明质酸合酶-1、透明质酸合酶-2、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原mRNA的表达，虽然表达量不同，但mRNA表达量增加和减少的时间点相似；在这两组中加入等量抗TGF-β1抗体，上述mRNA的表达量均下降，并且与对照组的表达量无显著性差异；蛋白质水平检测结果显示，两组中透明质酸和Ⅰ型胶原蛋白分泌增加及减少的趋势相同，并且Ⅰ型胶原蛋白的表达量相似。因此可以推断TGF-β1是ASC-CM中一个重要的旁分泌介质，决定透明质酸及胶原的合成。

ADSCs不仅可通过旁分泌的方式促进成纤维细胞增殖、迁移及分泌蛋白，而且可以在体内微环境的作用下表达HSP47，向成纤维细胞分化，促进真皮层的重建[6]。

1.3 促进再上皮化

在创面愈合过程中，表皮角质细胞的迁移、增殖和分化形成新的表皮层，是覆盖创面的必须过程之一，也是创面愈合的重要标志。赵京禹[7]在倒置显微镜下通过用200 μL枪头在培养有表皮细胞的平皿底部刮擦，制备100 μm宽度的“表皮创面”模型，观察到ADSCs可促进表皮细胞向创面中央迁移。移植ADSCs后的愈合组织进行免疫荧光染色，发现ADSCs在体内可表达CK19，表明ADSCs可在体内分化为表皮细胞，促进创面的再上皮化[6]。

1.4 促进血管重建

创面内新生血管的形成可以为创面提供氧、营养物质和生物活性蛋白，对创面修复具有重要作用。文献报道，将ADSCs移植于局部创面，取愈合组织进行免疫荧光染色后发现，ADSCs可表达血管内皮细胞标记物（CD31）、血管性血友病因子（von Willebrand Factor）、平滑肌肌动蛋白（SMA），提示ADSCs在体内可分化为内皮细胞和血管平滑肌细胞，参与新生血管的构建；同时，检测到ADSCs可在体内分泌VEGF、HGF，促进血管内皮的增殖和迁移，延长血管内皮细胞的寿命[2，8]。Altman等[8]证实了ADSCs可在体内新的微环境下向血管、上皮表型分化，可增加创面微血管密度，并促进血管充血。

1.5 促进创面收缩

肌成纤维细胞是由创面周围的成纤维细胞在各种刺激因子的作用下转变而来，是肉芽组织中的主要细胞成分。它不但保持了成纤维细胞的各种生理功能，而且具有平滑肌细胞的某些特点，与创面收缩有密切关系。Lee等[9]发现，ASCCM可促进成纤维细胞-胶原蛋白晶格复合物收缩，提示ASC-CM可诱导成纤维细胞表型向肌成纤维细胞转变，从而促进创面的收缩。

2 优化ADSCs治疗的方法

2.1 转基因

将干细胞疗法和基因疗法相结合，可以使ADSCs分泌某些因子的能力大大提高。Rehman等[10]通过编码VEGF的质粒转染ACSs，使ADSCs分泌VEGF的量增加了200倍。王先成[11]采用EGF腺病毒载体转染ADSCs，感染效率高达90%，检测转染后的ADSCs无染色体突变、生长曲线无明显变化。进一步通过PCR检测到了EGF基因的表达，ELISA检测到了EGF蛋白的高分泌。

2.2 诱导分化后移植

因ADSCs在体内的分化效率不高，有研究将ADSCs在体外诱导分化后再移植入体内，以加快创面愈合。王先成[11]将转染EGF基因的ADSCs体外诱导向表皮细胞分化，以表达角蛋白K19为诱导成功的标志，检测其诱导效率约为43.3%。将诱导后的细胞移植于裸鼠创面，所形成的新生上皮厚且分层明显，同时创面修复速度显著加快；此外，新生表皮组织EGF的表达量也较转基因未诱导ADSCs组显著增多。

赵京禹[7]将含10%FBS的DMEM与30%鼠皮肤匀浆液配成条件培养基，诱导ADSCs向表皮细胞分化，发现诱导ADSCs分化后条件培养基组比单纯EGF组CK19、CK14的阳性率高，差异有统计学意义。诱导前和诱导后3 d，处于S期的细胞所占的比例从30.29%提高至64.96%，表明细胞增殖速度加快，合成和代谢功能旺盛。他又采用另一种诱导方式，即将人表皮细胞与ADSCs间接共培养，检测发现实验组与对照组相比，ADSCs中CK19、CK14的阳性率高，差异有统计学意义。

2.3 与支架复合移植

2.3.1 Ⅰ型胶原

I型胶原由成纤维细胞所分泌，是细胞外基质的构成成分，广泛存在于结缔组织中。陆伟等[12]将ADSCs复合Ⅰ型胶原移植，可见大量成纤维细胞和微血管生长，光镜下胶原纤维呈蓝色，多且密集，与单纯ADSCs相比有显著差异。

2.3.2 纤维蛋白胶

纤维蛋白胶具有优良的生物相容性和体内可降解性，是组织工程领域应用较为广泛的一种支架材料。其网络状结构不仅为细胞的代谢、细胞的增殖移行提供场所和支架，而且它的许多成分，如纤维蛋白原和纤维连接素等，可以作为暂时性的细胞外基质，诱导和促进组织的再生。刘世宇等[13]将ADSCs复合纤维蛋白胶移植于小鼠创面，与单纯纤维蛋白胶移植相比上皮形成更好，胶原排列更有序，同时创区存在大量成纤维细胞。

2.3.3 透明质酸

透明质酸是细胞外基质的重要成分，可以促进细胞的迁移和增殖，并且参与一些细胞表面受体的相互作用。杨超等[14]制作放射性复合损伤模型，在损伤创面上滴加ADSCs-HA复合物以观察创面愈合情况。结果显示，在创面血管新生方面，ADSCs-HA复合物组新生微血管数量明显较HA组和空白对照组丰富，而HA组优于空白对照组，说明单纯HA对创面血管再生有促进作用，ADSCs-HA复合物促进血管新生的作用更显著。

2.3.4 丝素壳聚糖

壳聚糖具有低免疫原性、抗菌、易塑性和形成多孔结构的特点，有利于细胞在其内生长。但壳聚糖的细胞亲和性不高，细胞黏附性欠佳，丝素可以促进细胞的粘附和增殖，与壳聚糖起到互补的作用[15]。Altman等[8]将GFP标记的ACSs种植于丝素壳聚糖支架上，再将支架缝合于无胸腺小鼠全层皮肤缺损上。结果显示，ADSCs-SFCS组较对照组伤口的愈合速度显著提高。

2.3.5 人脱细胞羊膜

羊膜位于胎膜的最里层，是一种半透明膜。羊膜的许多特性使其能成为外科生物材料，如促进上皮再生、抑制纤维化、抗炎及抗血管生成特性、抗菌及抗病毒特性、高渗透压性、低免疫原性等。

马继中[16]将取自健康足月剖腹产产妇的羊膜进行脱细胞处理后，将ADSCs种植于其上，再将ADSCs复合人脱细胞基质羊膜缝合于创面上，发现创面愈合速度显著增加。

鞠晓军等[17]观察发现，人脱细胞羊膜两面具有不同的三维结构，上皮面为较致密的网状纤维，基质面为较稀疏的胶原纤维，未见纤维发生融合、断裂和降解。ADSCs-HAAM复合培养3 d后扫描电镜下可见细胞生长状态良好，胞体肥大呈梭形隆起，胞膜外绒毛致密略有弯曲，胞体下方形成丰富的伪足牢固黏附于HAAM上。检测ADSCs-HAAM组CK19表达明显高于对照组，创面愈合速度亦显著增加。

2.3.6 人脱细胞真皮基质

人脱细胞真皮基质因其具有无免疫原性、机械强度大及易操作等特点，在整形外科已经被广泛应用。Altman等[6]将脱细胞真皮基质作为运输ADSCs的载体，将ADSCs移植到小鼠的软组织缺损上，结果显示创面愈合加快。

2.4 在缺氧条件下培养

研究表明，ADSCs在体内有向缺氧组织迁移的能力。实验证实，ADSCs在缺氧条件下培养，增殖加快并分泌更多的细胞因子。Rehman等[10]发现，每106个ADSCs可分泌（1203± 254）pg血管内皮生长因子（VEGF），当ADSCs在缺氧条件下培养时，VEGF的分泌量提高5倍。从缺氧ADSCs获取的条件培养基可以显著提高内皮细胞的生长，并且减少内皮细胞的凋亡。

Lee等[18]将ADSCs在常氧和缺氧条件下培养，获得常氧和缺氧条件培养基hypoCM、norCM，发现缺氧条件下培养的ADSCs可以更好地生存及增殖；hypoCM可显著提高真皮成纤维细胞分泌I型胶原及迁移的能力；将CM涂抹于创面表面，hypoCM可显著促进创面的愈合；培养于缺氧环境的ADSCs可表达更多的VEGF及bFGF mRNA；另外，hypoCM中有更多VEGF及bFGF蛋白。

Moon等[19]证实，ADSCs的缺氧培养基可以在一定浓度范围内，通过RhoA-ROCK通路刺激应力纤维形成，从而促进角朊细胞的增殖、迁移；2-D凝胶分析及抗体阵列证实缺氧培养基中含有48种蛋白以及HGF、FGF-1、G-CSF、GMCSF、IL-6、VEGF和TGF-β3等细胞因子。其中，HGF可以刺激中性粒细胞、单核细胞和肥大细胞向创面迁移[20]，并且促进前血管生成因子的分泌[21]。IL-6可以促进角化细胞的迁移及增殖[22]。GM-CSF在创面愈合过程的炎症反应中发挥重要作用，可以提高创面中性粒细胞的功能[23]。此外，GM-CSF可促进角化细胞增殖，从而提高了上皮化。TGF-β3可以通过促进角化细胞迁移来加快创面愈合。VEGF促进血管内皮细胞的增殖和迁移，延长血管内皮细胞的寿命。FGF可促进血管内皮细胞的增殖，加快新生血管的长入。

3ADSCs移植途径与全身分布情况

Suga等[24]将ADSCs通过三种途径，即静脉注射、腹腔内注射、皮下注射移植入小鼠体内，结果发现不论是何种途径，细胞均能迁移至脑、心、肝、肺、网膜脂肪等组织器官内。并且测得采用腹腔内注射的细胞途径，细胞迁移至各脏器后占脏器总细胞的比例为：肺36.95‰，脾15.7‰，肾、脑、肝均为4‰左右，其次为胰腺、心脏、骨骼。但是在外周血及骨髓中未发现移植的细胞。

南华等[25]将ADSCs标记后，通过尾静脉移植到创伤鼠体内。结果显示，实验组较对照组创口收缩率大，创面完全愈合时间短，新生血管形成、成纤维细胞、腺样结构更为明显。多个器官标本行快速冰冻切片，荧光显微镜下观察到肺、脾中滞留大量且较强的荧光，肝、心、肾内可见较多细弱荧光，远隔部位的正常皮肤软组织仅见少量荧光；创面愈合组织中所见的荧光要多于正常皮肤组织且分布相对有规律。对照组均未见有荧光。他们又将创面局部注射和尾静脉注射对创面愈合速度及细胞分布情况的影响进行比较。发现当两种途径注入等量ADSCs时，局部途径创面愈合相对较快，但是在愈合时间上与全身途径比较并无显著差异。组织学观察发现局部途径创面内形成不成熟的腺样结构相对较多，全身途径创面内新生血管形成更为明显[26]。

4 临床应用

4.1 放射性损伤

Rigotti等[27]对20个接受放射治疗后出现副作用（严重症状或不可逆功能损伤，LENT-SOMA评分3~4级）的患者进行ADSCs治疗，将ADSCs通过低侵入性的电脑辅助注射，移植入靶部位。治疗后的31个月中，靶部位的超微结构显示了组织的逐步再生，包括新生血管形成和水化的提高。所有被评估的者都出现了症状的缓解。

4.2 复杂性肛瘘

Garcia-Olmo等[28]通过第二阶段的多中心随机对照试验，探索了ADSCs对复杂性肛瘘治疗的有效性和安全性。在ADSCs治疗后8周和1年，评估瘘的愈合及生活质量。结果显示ADSCs可加快肛瘘的愈合，并且提高患者的生活质量分数。

4.3 鼻部区域性坏死

Sung等[29]报道了两例因鼻部填充剂注射，鼻部出现焦痂及区域性坏死等急性并发症的患者，予以鼻部清创后在创面皮下和真皮层局部注射ADSCs。注射细胞后未予以其他任何治疗，8~10 d后创面完全上皮化，数月后皮肤上只留有一条不明显的线状瘢痕，并且没有瘢痕收缩引起的不对称或畸形。

综上所述，脂肪干细胞可以在创面愈合的各个阶段发挥作用，但是其体内分化及旁分泌作用机制及效率仍未完全清楚。脂肪干细胞可以通过与基因治疗联合、改进移植方式及改变培养条件等，增强它的分化及分泌功能，局部或全身不同的细胞移植途径对创面愈合的作用亦有不同。相信在不远的将来，通过对脂肪干细胞在体内的作用机制、有效性及安全性进行更深入的探索及研究，可以使脂肪干细胞更广泛地应用于临床，给创面不愈或难愈的患者提供新的治疗手段。

[1]Zuk PA,Zhu M,Ashjian P,et al.Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells[J].Mol Biol Cell,2002,13(12)：4279-4295.

[2]Nie C,Yang D,Xu J,et al.Locally administered adipose-derived stem cells accelerate wound healing through differentiation and vasculogenesis[J].Cell Transplant,2011,20(2)：205-216.

[3]董瑶,董飞君,李幼华.脂肪干细胞调节创面炎症反应并促进创面愈合[J].医学研究杂志,2012,41(3)：100-103.

[4]Kim WS,Park BS,Sung JH,et al.Wound healing effect of adiposederived stem cells：A critical role of secretory factors on human dermal fibroblasts[J].J Dermatol Sci,2007,48(1)：15-24.

[5]Jung H,Kim HH,Lee DH,et al.Transforming growth factor-beta 1 in adipose derived stem cells conditioned medium is a dominant paracrine mediator determines hyaluronic acid and collagen expression profile[J].Cytotechnology,2011,63(1)：57-66.

[6]Altman AM,Matthias N,Yan Y,et al.Dermal matrix as a carrier for in vivo delivery of human adipose-derived stem cells[J]. Biomaterials,2008,29(10)：1431-1442.

[7]赵京禹.脂肪及脂肪源性干细胞促进创面修复的基础研究[D].北京：中国人民解放军军医进修学院,2007：1-92.

[8]Altman AM,Yan Y,Matthias N,et al.IFATS collection：human adipose-derived stem cells seeded on a silk fibroin-chitosan scaffold enhance wound repair in a murine soft tissue injury model [J].Stem Cells,2009,27(1)：250-258.

[9]Lee SH,Jin SY,Song JS,et al.Paracrine effects of adiposederived stem cells on keratinocytes and dermal fibroblasts[J]. Ann Dermatol,2012,24(2)：136-143.

[10]Rehman J,Traktuev D,Li J,et al.Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J].Circulation, 2004,109(10)：1292-1298.

[11]王先成.EGF基因转染人脂肪干细胞体外诱导表皮细胞修复创面的实验研究[D].北京：中国协和医科大学研究生院,2006：1-99.

[12]陆伟,金岩,张勇杰,等.脂肪组织来源干细胞复合胶原构建组织工程皮肤修复皮肤缺损[J].实用口腔医学杂志,2007,23(2)：161-164.

[13]刘世宇,陆伟,张晓军,等.脂肪干细胞和纤维蛋白胶快速构建人工皮肤修复创面的研究[J].实用口腔医学杂志,2009,25(6)：769-773.

[14]杨超,邢新,徐达圆,等.脂肪干细胞-透明质酸复合物促进放射性复合损伤创面愈合的初步研究[J].中国修复重建外科杂志, 2011,25(12)：1499-1503.

[15]Vachiraroj N,Ratanavaraporn J,Damrongsakkul S,et al.A comparison of Thai silk fibroin-based and chitosan-based materials on in vitro biocompatibility for bone substitutes[J].Int J Biol Macromol,2009,45(5)：470-477.

[16]马继中.羊膜负载脂肪来源干细胞修复大鼠皮肤缺损的实验研究[D].南昌：南昌大学第一附属医院,2011：1-40.

[17]鞠晓军,潘锋,柏树令,等.人脱细胞羊膜复合脂肪源性干细胞修复大鼠全层皮肤缺损的实验研究[J].中国修复重建外科杂志, 2010,24(2)：143-149.

[18]Lee EY,Xia Y,Kim WS,et al.Hypoxia-enhanced wound-healing function of adipose-derived stem cells：Increase in stem cell proliferation and up-regulation of VEGF and bFGF[J].Wound Repair Regen,2009,17(4)：540-547.

[19]Moon KM,Park YH,Lee JS,et al.The effect of secretory factors of adipose-derived stem cells on human keratinocytes[J].Int J Mol Sci,2012,13(1)：1239-1257.

[20]Bevan D,Gherardi E,Fan TP,et al.Diverse and potent activities of HGF/SF in skin wound repair[J].J Pathol,2004,203(3)：831-838.

[21]Dong G,Lee TL,Yeh NT,et al.Metastatic squamous cell carcinomacellsthatoverexpressc-Metexhibitenhanced angiogenesis factor expression,scatteringandmetastasisin response to hepatocyte growth factor[J].Oncogene,2004,23(37)：6199-6208.

[22]Sato M,Sawamura D,Ina S,et al.In vivo introduction of the interleukin 6 gene into human keratinocytes：Induction of epidermal proliferation by the fully spliced form of interleukin 6,but not by the alternatively spliced form[J].Arch Dermatol Res,1999,291 (7-8)：400-404.

[23]Mann A,Breuhahn K,Schirmacher P,et al.Keratinocyte-derived granulocyte-macrophage colony stimulating factor accelerates wound healing：Stimulation of keratinocyte proliferation,granulation tissue formation,and vascularization[J].J Invest Dermatol, 2001,117(6)：1382-1390.

[24]Suga H,Eto H,Shigeura T,et al.IFATS collection：fibroblast growth factor-2 induced hepatocyte growth factor secretion by adipose-derived stromal cells inhibits postinjury fibrogenesis through a c-Jun N-terminal kinase-dependent mechanism[J]. Stem Cells,2009,27(1)：238-249.

[25]南华,高建华,鲁峰.静脉移植的脂肪来源干细胞在创伤鼠体内的分布[J].中国美容医学,2009,18(6)：802-806.

[26]南华,高建华,鲁峰,等.脂肪组织来源干细胞促进软组织创面愈合的实验研究[J].南方医科大学学报,2010,30(12)：2633-2636.

[27]Rigotti G,Marchi A,Galiè M,et al.Clinical treatment of radiotherapy tissue damage by lipoaspirate transplant：a healing process mediated by adipose-derived adult stem cells[J].Plast Reconstr Surg,2007,119(5)：1409-1422.

[28]Garcia-Olmo D,Herreros D,Pascual I,et al.Expanded adiposederived stem cells for the treatment of complex perianal fistula：a phase II clinical trial[J].Dis Colon Rectum,2009,52(1)：79-86.

[29]Sung HM,Suh IS,Lee HB,et al.Case reports of adipose-derived stem cell therapy for nasal skin necrosis after filler injection[J]. Arch Plast Surg,2012,39(1)：51-54.

Research Progress of Adipose-derived Stem Cells on Wound Healing

YU Xiaofan,XIONG Meng.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Zhongda Hospital,Southeast University.Corresponding author:XIONG Meng(E-mail: bearbrave@sina.com).

Adipose-derived stem cells;Wound healing;Clinical application

Q813.1+1

B

1673－0364（2013）02－0109－04

2013年1月17日；

2013年2月25日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.02.012

210009江苏省南京市中大医院整形外科。

熊猛（E-mial：bearbrave@sina.com）。

【Summary】Would healing is a complicated process,involving multiple cells and various cytokines.Non or poor healing wound still remains to be a big challenge for plastic surgeons.With the deepening of ADSCs researches and clinical applications,ADSCs hold great promise in the wound healing strategies.This review aims to summarize the mechanism of how ADSCs promote would healing,the advanced ADSCs based strategies,the transplantation of the ADSCs and the clinical applications.