基于线粒体16SrRNA基因徂徕林蛙（R.culaiensis）与镇海林蛙（R.zhenhaiensis）的物种分化

杨宝田，周 瑜，李学龙

（沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳 110034）

基于线粒体16SrRNA基因徂徕林蛙（R.culaiensis）与镇海林蛙（R.zhenhaiensis）的物种分化

杨宝田，周 瑜，李学龙

（沈阳师范大学化学与生命科学学院，沈阳 110034）

目前对徂徕林蛙的描述仅限形态学分析，对其与近缘物种的分化及物种有效性尚缺乏分子生物学研究。笔者对徂徕林蛙所属长肢林蛙种组物种及其他林蛙属物种的线粒体16S r RNA基因部分序列进行分析，得到序列长度521bp。遗传变异分析显示徂徕林蛙与镇海林蛙以及峨眉林蛙遗传距离很近（均为0.9%），表明徂徕林蛙在进化过程中是一个紧密连接镇海林蛙与峨眉林蛙的物种。系统发育树分析显示徂徕林蛙与镇海林蛙构成姐妹群，徂徕林蛙与镇海林蛙处于物种分化过程中的并系阶段，其物种分化还未完全完成。

16S rDNA；徂徕林蛙；镇海林蛙；物种分化

0 引 言

林蛙（brown frog）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）林蛙属（Rana）［1］。中国的林蛙属物种共16种，其中包括近年发表的新种猫儿山林蛙（R.maoershanensis）［2］、徂徕林蛙（R.culaiensis）［3］和R.jiemuxiensis［4］，可划分为3个种组［5］。徂徕林蛙仅分布于山东徂徕山，隶属长肢林蛙种组（R.longicrus species group），曾被视为镇海林蛙（R.zhenhaiensis）［6］，Li et al.（2008）通过对比其与镇海林蛙和峨眉林蛙的形态学特征，将其定为新种。

近年来随着分子生物学的迅速发展，采用DNA序列分析探讨物种的分化，构建分子系统发育树已成为系统学和分类学中不可缺少的组成部分。动物线粒体基因表现为母系遗传，因其分子量小、进化速度快［7］等特性被广泛地用于亲缘关系鉴定、遗传多样性分析、分子地理演化和系统发育研究。应用线粒体DNA进行遗传分化和物种有效性研究在林蛙属物种中已得到广泛应用［8－9］。Li et al.（2008）在新种描述中仅将徂徕林蛙与其他林蛙在形态学上进行了比较分析，尚缺少分子生物学证据。本研究应用线粒体16S r RNA基因部分序列对徂徕林蛙与其他长肢林蛙种组物种进行了系统发生关系分析，探讨它们之间的遗传分化和系统演化关系，进而为徂徕林蛙的分类地位及物种有效性提供分子生物学证据。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和DNA提取

本文采用Frost（2011）的分类学命名规则。共对本实验室采集的5个徂徕林蛙样本的16S r RNA基因进行了测序，并结合本实验室已发表的寒露林蛙和中国林蛙序列［9］以及在GenBank收集的数据［10－13］进行了分析。其中作为内群的有长肢林蛙种组物种：徂徕林蛙（R.culaiensis）、寒露林蛙（R.hanluica）、镇海林蛙（R.zhenhaiensis）、峨眉林蛙（R.omeimontis）和昭觉林蛙（R.chaochiaoensis），以及中国林蛙（R.chensinensis），张村蛙（R.zhengi），R.sauteri，R.shuchinae，R.johnsi。选择侧褶蛙属（Pelophylax）的黑斑侧褶蛙（P.nigromaculata）与Lithobates属的L.catesbeiana做为外群（表1）。采集的5个徂徕林蛙样品为肝脏组织，保存于浓度为95%的乙醇溶液中，－20℃冰箱保存。肝脏样品总DNA提取采用标准的蛋白酶K消化和酚／氯仿抽提的方法［14］。

表1 样本及16S rRNA基因序列信息

1.2 DNA扩增、序列测定和分析

用于扩增mt DNA 16S r RNA基因的引物为F51（5'CCCGCCTGTTTACCAAAAACA3'）（Moritzet al.，1992）和R51（5'GGTCTGAACTCAGATCACGTA3'）［15］。PCR扩增在ABI 9700型扩增仪上完成。反应总体积为25μl。扩增反应条件：94℃预变性5min，然后进行94℃变性30s、46℃退火30s、72℃延伸60s，35个循环，最后72℃延伸5min。PCR产物交由北京六合华大基因有限公司进行双向测序，以确保序列的准确性。采用Lasergene 7.10软件拼接双向测得的序列，用CLUSTAL［16］进行序列比对，并辅以手工编辑。用DnaSP 4.00［17］进行单倍型分析，采用MEGA 5.0［18］软件计算Kimura双参数遗传距离。

以P.nigromaculata和L.catesbeiana为外群，采用最大似然法（maximum likelihood，ML）和邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树。ML树用RAx ML 7.0.4软件［19］完成，同时进行1000次重复抽样的bootstrap分析，检验各节点的置信度。ML树的最佳模型为（GTR＋G）由Mr Modeltest 2.3［20］软件分析得出。用Mega 5.0［18］，基于Kimura双参数模型，用NJ法构建系统进化树并进行1000次重复抽样的bootstrap分析。

2 结果与分析

2.1 林蛙属物种16S rRNA基因序列及变异

所有27个样品16S r RNA基因，经过比对编辑，得到有效序列长度为521bp。共检测到107个可变位点，约占核苷酸总数的20.53%。插入和缺失位点数共26个。使用Mega 5.0中的Kimura双参数法计算这内群物种遗传距离（表2）。中国林蛙属物种遗传变异范围处于0.9%～8.4%，物种间平均遗传距离为5.5%，徂徕林蛙与其他林蛙物种的遗传变异为0.9%～7.1%。其中徂徕林蛙与镇海林蛙和峨眉林蛙遗传距离最小（均为0.9%），峨眉林蛙与镇海林蛙的遗传距离为1.8%。

表2 林蛙属物种16S rRNA基因部分序列Kimura's two-parameter遗传距离

2.2 系统发育关系

用邻接法（neighbor-joining，NJ）和最大似然法（maximum likelihood，ML）分别对所收集到林蛙物种做分子系统发育分析，P.nigromaculata和L.catesbeiana作为外群。两种分析得到的系统发育树的拓扑结构大致相似，所以选择ML树为例（图1）。从分子系统树中可以看出，徂徕林蛙与镇海林蛙各自组成了自己单独的支系并构成姐妹群再与峨眉林蛙构成的单系群聚合。虽然徂徕林蛙所在支系的单系性支持度较低（NJ，41／ML，56），但徂徕林蛙与镇海林蛙的节点支持度很高（NJ，95／ML，84）。由徂徕林蛙、镇海林蛙、峨眉林蛙、寒露林蛙和长肢林蛙构成的长肢林蛙种组也得到了支持（NJ，81／ML，94）。

图1 线粒体16S rRNA基因部分序列构建的系统发育树，枝上的数字分别为节点的NJ树自举值／ML树自举值

3 讨 论

林蛙（特别是长肢林蛙种组）是一个复杂的类群。镇海林蛙是由叶昌媛等（1995）从日本林蛙（R.japonica）中分离并命名的物种，分布于中国东南部的浙江、福建、安徽、江西、江苏、湖南、广东和广西等地。有研究发现，镇海林蛙也间断性的分布于华北地区的天津蓟县和山东徂徕山两个局部地区［21－23］，但对于此曾受到部分学者的质疑［6］。Liet al.（2008）经过形态学比较研究，认为山东徂徕山的林蛙与镇海林蛙和峨眉林蛙均存在差异，将其定为一新种——徂徕林蛙（R.c u l a i e n s i s）［3］。

线粒体16S r RNA基因是研究种内或近缘种间系统发育和演化问题常用的工具之一，并且其序列差异被广泛用于林蛙属物种研究［9，13］。本研究在对中国林蛙属物种遗传距离分析中，徂徕林蛙与镇海林蛙和峨眉林蛙的遗传距离均为0.9%（表2），而镇海林蛙与峨眉林蛙的遗传距离为1.8%。徂徕林蛙、镇海林蛙和峨眉林蛙3个物种间的遗传距离显示，徂徕林蛙是一个在遗传进化方面连接镇海林蛙与峨眉林蛙的中间物种。在由线粒体16S r RNA基因部分序列构建的NJ树和ML系统发育树中，徂徕林蛙、镇海林蛙和峨眉林蛙构成了一个进化支（支持率NJ，81／ML，79），3种林蛙系统地位很近。徂徕林蛙样本构成的单系群自举值支持率不高（NJ，41／ML，56），但其与镇海林蛙构成的单系群的节点支持率很高（NJ，95／ML，84），说明徂徕林蛙是一个既有别于镇海林蛙又具很近亲缘关系的物种。

遗传变异、自然选择和隔离是物种形成的3个主要因素。达尔文认为，渐进式物种形成是物种分化的主要方式。该方式在物种内部分异之初，某种（或几种）自然物理因素阻碍种群间基因交流，从而使得种群间遗传差异逐步增大，经过若干中间阶段，最后达到种群间完全的生殖隔离和新种形成。在这里，环境因素造成的隔离是渐进式物种形成的必要条件，而环境阻隔本身也有一个形成和发展的渐进过程，并且可能与被分隔种群间遗传差异的积累协同进行。研究推测，徂徕林蛙和镇海林蛙的祖先种分布区很广，由于自然环境因素的作用某些种群呈现间断性分布且相距较远，这就形成了一定地理隔离，地理隔离使这些种群之间的基因交流出现障碍。由于栖息地环境的差别及长期适应的结果，隔离种群逐步在生态系统中占据了一个新的生态位。同时，两栖动物的扩散能力较差又加剧了祖先种群间基因交流的阻遏作用。

结合形态学方面（头长、头宽、眼直径和鼓膜直径等）的对比研究结果［3］，初步认为徂徕林蛙是一个介于镇海林蛙与峨眉林蛙之间的中间物种，并与镇海林蛙有更近亲缘关系。该物种属渐进式物种形成的邻域型物种演化途径［24］，与镇海林蛙处于物种分化过程中的并系阶段［25］，从某种程度上说徂徕林蛙的物种分化还未完全完成。

4 结论与建议

1）徂徕林蛙是一个在遗传进化方面连接镇海林蛙与峨眉林蛙的中间物种，与镇海林蛙亲缘关系密切；

2）徂徕林蛙与镇海林蛙处于物种分化过程中的并系阶段，其物种分化还未完全完成；

3）本研究仅使用了线粒体16r RNA基因部分序列进行分析，有必要选择更多基因片段，特别是核基因做进一步更深入研究。

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Species differentiation ofR.culaiensisandR.zhenhaiensisbased on partial sequences of mitochondrial 16S r DNA

YANG Baotian，ZHOU Yu，LI Xuelong

（College of Chemistry and Life Science，Shenyang Normal University，Shenyang 110034，China）

Rana culaiensisfound in Mt.Culai in Shandong，China was reported as a new species just based on morphological analysis；there are no molecular data about the phylogenetic relationships and speciation process for this frog.The partial sequences（521bp）of 16S r RNA gene from 25specimens of the brown frog species distributed in China and Japan were analyzed.The nucleotide sequence divergence betweenR.culaiensisandR.zhenhaiensiswas 0.9%，as well as betweenR.culaiensisandR.omeimontis.The phylogenetic relationships based on NJ and ML indicated thatR.culaiensisandR.zhenhaiensisconstitute a sister group.It is suggested thatR.culaiensiswas closely related toR.zhenhaiensis，and the speciation ofR.culaiensisare in paraphyletic stage and not completed.

16S rDNA；R.culaiensis；R.zhenhaiensis；species differentiation

Q38

A

10.3969／j.issn.1673-5862.2013.02.003

1673-5862（2013）02-0143-05

2013-03-07。

国家林业局全国第二次陆生野生动物资源调查项目；沈阳师范大学第十批校级重点课程建设项目；沈阳师范大学实验中心主任基金资助项目（SY200902）。

杨宝田（1963-），男，辽宁沈阳人，沈阳师范大学副教授，博士，硕士研究生导师。