北方狭口蛙消化道5－羟色胺细胞的免疫组织化学定位

2013-01-17 12:21黄淑丽金晨晨牛鑫鑫咸振飞曹双凤张志强

中国组织化学与细胞化学杂志 2013年1期

黄淑丽金晨晨牛鑫鑫咸振飞曹双凤张志强＊

（安徽农业大学1生命科学学院；2动物科技学院，合肥230036）

5－羟色胺（5－hydroxytryptamine，5－HT）是脊椎动物消化道中含量和分布范围较广的一种激素［1－3］。免疫组织化学研究表明，两栖动物消化道（胃肠道或肠道）各段均有5－HT 细胞存在［2－19］，且大多集中分布于胃幽门部［3－11］和／或十二指肠［12－15］。然而，也有一些例外情况，如东方玲蟾（Bombina orientalis）［16］、中国林蛙（Rana chensinensis）［17］和黑框蟾蜍（Bufo melanostictus）［6］的分布密度高峰分别位于食管、胃贲门部和回肠等处，且目前尚未发现分布型完全一致的两栖类动物［2－19］。两栖类消化道内分泌细胞分布型的多样性可能与多种因素有关，如彼此之间的系统发育关系、不同的生活史过程和食性差异等［1］。

北方狭口蛙（Kaloula borealis）隶属于两栖纲（Amphibian）无尾目（Anura）姬蛙科（Microhylidae）狭口蛙属（Kaloula），以白蚁和小型昆虫为食。不同食物配比可影响北方狭口蛙消化系统的形态和发育历程［20］，但尚无消化道组织学方面的报道。本文采用SABC免疫组织化学法，对北方狭口蛙消化道5－HT细胞进行了定位研究，拟丰富两栖动物比较组织学和内分泌学的基础资料，为深入认识该蛙的消化生理适应性提供形态学基础。

材料和方法

1．材料

北方狭口蛙于2012年6月下旬捕于安徽省蚌埠市固镇县石湖乡钟黄村，取雌雄蛙各6只，称量体重（6．735±0．341g）和体长（34．88±0．76mm）后，用双毁髓法处死动物，迅速取出消化道各段（食管、胃贲门部、胃体、胃幽门部、十二指肠、空肠、回肠和直肠），每段截取0．5－1cm长组织，用生理盐水清洗后，迅速投入不含冰醋酸的Bouin’s液固定18－24 h，常规脱水透明，石蜡包埋，切片（5μm）。

2．主要试剂

即用型（ready to use）5－HT抗血清（兔抗人，产品代号为ZA－0231）和SP－9000型免疫组织化学试剂盒购于北京中杉金桥生物技术有限公司，由美国ZYMED公司生产。

3．免疫组织化学方法

常规石蜡切片脱蜡至水。用0．3%H2O2甲醇溶液孵育15min，0．01mol／L PBS冲洗3次×5 min，滴加正常山羊血清，室温孵育15min，吸去多余血清，滴加一抗，4℃过夜。PBS洗涤3次×5 min，滴加即用型生物素标记的二抗（羊抗兔IgG抗血清），室温孵育60min。PBS洗涤2次×5min，滴加即用型链霉菌抗生物素蛋白－过氧化物酶，室温孵育60min。PBS浸洗2次×5min，DAB－H2O2显色，蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片。阴性对照，分别以正常羊血清和PBS代替一抗，其余步骤同上。

4．观察与细胞计数

在Motic－BA 210型显微镜下观察，拍照，计数。光学显微镜下，5－HT免疫反应阳性细胞呈深棕色，细胞核不着色或呈淡黄色，背景呈浅蓝色，容易区分。阴性对照片均未见深染的细胞。对每只蛙消化道各段的每个部位，在400倍视野下，计数5张切片30个视野中5－HT细胞数量的平均值，表示该只蛙该部位的数量，最后以12只蛙的平均值表示消化道各段5－HT细胞的数量，并统计开放型和闭合型细胞的数量，计算其比值。开放型和闭合型细胞的比值＝开放型细胞的数量／闭合型细胞的数量×100%。

5．统计分析

用SPSS 13．0for windows进行数据处理。经Kolmogorov－Simirnov test检验，所有数据均符合正态分布。以单因素方差分析（one－way ANOVA）及多重比较（multiple comparisons）post hoc test统计消化道各段5－HT开放型和闭合型细胞的比值及数量。文中数据均以平均值 ± 标准误（mean±SE）表示，P＜0．05为差异显著，P＜0．01为差异极显著。

结果

1．5－HT细胞的形态学特征

食管5－HT细胞主要分布于上皮细胞之间，少数见于基底膜，多呈长楔形、长棒状、梨形、锥体形或蝌蚪状（图1、2），少数呈圆形（图3）。胃部5－HT细胞主要分布于胃腺上皮细胞之间。贲门5－HT细胞多呈楔形或三角形（图4），少数圆形（图5）；胃体圆形细胞（图6）的数量与锥体形和棒状细胞的数量相当（图7）；幽门以圆形细胞为主（图8），楔形或棒状细胞较少（图9）。肠道5－HT细胞主要分布于肠上皮细胞之间。十二指肠5－HT细胞多呈长锥体形，具有伸向肠腔或同时伸向两端的胞突（图10），偶见圆形细胞（图11）；空肠5－HT细胞多呈长棒状（图12）；回肠5－HT细胞多呈锥体形（图13），鲜见椭圆形细胞（图14）；直肠5－HT细胞多呈短圆锥形或锥体形（图15）。

2．5－HT细胞的分布密度

5－HT细胞在幽门密度最高，胃体和十二指肠其次，食管、空肠、回肠和直肠密度较低，贲门最低（F7，88＝5．961，P＜0．01）（表 1）。

3．5－HT开放型和闭合型细胞的比值

北方狭口蛙消化道5－HT开放型和闭合型细胞的比值大体呈“V”形，变化范围为0．6－26．7，幅度较大。食管和贲门以开放型细胞为主，从贲门至幽门，开放型细胞的数量逐渐减少，至幽门达到低谷；肠道各段，从十二指肠至直肠开放型细胞的数量显著升高，只偶见闭合型细胞（F7，88＝8．026，P＜0．01）（表1）。

表1 北方狭口蛙消化道各段5－羟色胺细胞分布密度（单位：个／400×视野）及开放型与闭合型细胞的比值（单位：%）。平均值 ± 标准误。同一列中字母不同表示差异显著，含有相同字母表示差异不显著，a＞b＞c；A＞B＞C。Table 1 Distributive density of 5－hydroxytryptamine（5－HT）－producing cells（Unit：number of cells／400 times field）and ratio（Unit：%）between open and closed populations of 5－HT cells along the different regions of digestive tract of Kaloula borealis．Mean ± SE．Different letters for the same column mean significant differences，while the same column with the same letters is not significant between groups，a＞b＞c；A ＞B＞C．

讨论

北方狭口蛙整个消化道都有5－HT细胞分布，其分布密度在胃幽门部最高，贲门最低，分布型与大多数两栖动物相似，但也有自身的独特性；消化道各段开放型和闭合型细胞的比值呈“V”形波动，这与其他两栖动物不同。

5－HT细胞是消化道所含各类内分泌细胞的主要类型之一，见于各类脊椎动物的消化道中［1－3］。包括食管在内，北方狭口蛙消化道各段均有5－HT细胞分布，这与其他两栖动物相同［3－10，12，13，16－19，22］。北方狭口蛙消化道5－HT细胞在胃幽门部密度最高，贲门最低。研究发现，半数以上的两栖动物消化道5－HT细胞的分布密度高峰位于胃幽门部［2－9］，低谷位于消化道两端［4－10，12，19］；然而，也有一些例外情况，如中国林蛙（Rana chensinensis）的分布密度高峰位于胃贲门部［17］；粗皮蛙（Rana rugosa）、虎纹蛙（Rana rugulosa）、牛蛙（Rana calesbeiana）和黑框蟾蜍（Bufo melanostictus）则分别在胃体［18］、十二指肠［12］、空肠［19］和回肠［6］分布密度最高。北方狭口蛙的食性与大多数两栖动物相似，均是以肉食性为主的杂食性动物，喜食白蚁和小型昆虫。北方狭口蛙体型较小，发育历期较短，多栖息于水坑或房屋附近的草丛中、土穴内或石下［20］。北方狭口蛙胃幽门部密度最高，胃体和十二指肠也有较多的5－HT细胞分布，但食管和肠道后段5－HT细胞数量明显较少。这种分布型可能有助于食物逐渐进入胃部，加快处理食物的速度和效率。

形态学上，北方狭口蛙消化道5－HT细胞可分为开放型和闭合型细胞两种类型，前者主要呈锥体形、长梭形或楔形，具有胞突伸向管腔或邻近细胞，后者多呈圆形或椭圆形。两者的比例在胃幽门部最低，回肠和直肠最高。5－HT主要由肠粘膜层的嗜铬细胞分泌产生，物理刺激和化学信号均能促进其分泌［1］。北方狭口蛙从食管至胃幽门部，开放型细胞的数量逐渐下降，这可能与食物对食管的刺激较强，之后对胃部的机械刺激作用逐渐减弱有关，有助于食物的润滑和下行。两栖动物普遍具有较强的耐受饥饿的能力，机械刺激能促进5－HT细胞的分泌［21］。北方狭口蛙在饱食状态下胃部囤积闭合型细胞，可能通过缓释的途径对营养物质的消化起调控作用。从十二指肠至直肠，北方狭口蛙几乎都为开放型细胞，这与其他两栖类动物肠道段开放型和闭合型细胞的比值从十二指肠至直肠逐渐下降的趋势相反［15］。十二指肠、空肠和回肠是北方狭口蛙消化和吸收营养物质的主要场所，较多数量开放型细胞的存在，有助于食物的消化和吸收过程的进行。直肠大部分细胞为开放型细胞，可能与食物残渣的排出和水分的重吸收过程有关。5－HT可能通过外分泌的途径参与食物的消化、吸收和食物残渣的排出过程［1］。

总之，北方狭口蛙整个消化道的5－HT细胞与其他两栖动物相比，既有相同之处，也有自身的独特性。除食性和穴居掘土的生活方式可能影响其消化道5－HT细胞的分布型和形态外，消化生理状态也是一个需要重点考虑的因素，值得进一步研究和探索。

图版说明

图1 食管长棒形的5－HT细胞×400

图2 食管蝌蚪形的5－HT细胞×400

图3 食管圆形的5－HT细胞×400

图4 胃贲门部圆形的5－HT细胞×400

图5 胃贲门部三角形的5－HT细胞×400

图6 胃体圆形的5－HT细胞×400

图7 胃体棒状的5－HT细胞×400

图8 胃幽门部圆形的5－HT细胞×400

图9 胃幽门部楔形的5－HT细胞×400

图10 十二指肠伸向肠腔的锥体形5－HT细胞×400

图11 十二指肠圆形的5－HT细胞×400

图12 空肠长棒状的5－HT细胞×400

图13 回肠锥体形的5－HT细胞×400

图14 回肠椭圆形的5－HT细胞×400

图15 直肠短圆锥形和锥体形的5－HT细胞×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig．1Long bar－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．2Tadpole－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．3Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of esophagus．×400

Fig．4Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus cardiacus．×400

Fig．5Triangle－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus cardiacus．×400

Fig．6Round－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus corpus．×400

Fig．7Bar－shaped 5－HT cells in the epithelium of stomachus corpus．×400

Fig．8Round－shaped 5－HT cells in the stomachus pyloricus．×400

Fig．9Wedge－shaped 5－HT cells in the stomachus pyloricus．×400

Fig．10Pyramid－shaped 5－HT cells in the duodenum，the long cytoplasmic process extending to its intestinal cavity．×400

Fig．11Round－shaped 5－HT cells in the duodenum．×400

Fig．12Long bar－shaped 5－HT cells in the jejunum．×400

Fig．13Pyramid－shaped 5－HT cells in the ileum．×400

Fig．14Oval－shaped 5－HT cells in the ileum．×400

Fig．15Short pyramid and pyramid shaped 5－HT cells in the rectum．×400

EP：上皮（epithelium）SG：胃腺（stomach gland）标尺（scale）＝15μm