高脂饮食对小鼠附睾内质网应激的影响及褪黑素的干预作用

余荣娇 张 凯＊ 吕正梅 刘 茜 洪 燕

（1安徽中医学院组胚生物学教研室，合肥230038；2安徽医科大学组织胚胎学教研室，合肥230032）

高脂饮食是非胰岛素依赖型糖尿病、心脑血管病、骨关节炎、肿瘤和某些生殖和代谢性疾病发病的危险因素［1］。由于影响性激素水平，所以认为高脂饮食也会影响生殖功能［2］。研究发现高脂饮食导致精液质量下降，精子密度降低，活力下降，精子DNA碎片参数增加［3－5］。近年来，高脂饮食对睾丸功能的影响研究较多，但是对附睾的影响未见报道。附睾是哺乳动物精子成熟、获能、储存和保护精子的重要器官，附睾受损伤将会影响精子的成熟，降低雄性哺乳动物的生育能力。内质网应激相关分子葡萄糖调节蛋白78（glucose regulatedprotein78，GRP78）和c／EBP同源蛋白（c／EBP homologous protein，CHOP）参与睾丸损伤过程，影响睾丸功能［6］，但在附睾的损伤中报道较少。本研究通过高脂饲料喂养小鼠以及褪黑素（melatonin，MT）干预性处理，观察附睾组织形态学变化及GRP78和CHOP的表达，探讨高脂饮食引起小鼠附睾损伤的可能机制及MT的治疗机制。

材料和方法

1．实验动物及分组

18只C57BL／6J雄性小鼠，其中12只为ApoE基因敲除的C57BL／6J雄性小鼠，6只为普通野生型小鼠（购自中国协和医科大学，SPF级）。12只ApoE基因敲除小鼠随机分为高脂饮食组和MT处理组：高脂饮食组予以高脂饲料（0．5%胆固醇、10%猪油、10%蛋黄粉、20%蔗糖、59．5%普通饲料）喂养，MT处理组给予高脂饮食外，每天予MT（1mg／kg）灌胃治疗。6只野生型小鼠，给予普通饲料喂养，作为对照组。每组动物皆单笼饲养，自由进食、饮水。12w后麻醉、处死及取材。

2．药物和主要试剂

MT购自Sigma公司；GRP78、CHOP皆购自Bioworld公司；SABC免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物工程有限公司。

3．方法

3．1附睾组织病理学观察

取双侧附睾头用4%甲醛固定24h，石蜡包埋。常规切片，切片厚为5μm，HE染色，脱水，透明，封片，×400镜下观察附睾组织病理学变化。

3．2免疫组织化学染色

石蜡切片脱蜡至水，枸橼酸盐煮沸修复6－8min；3%H2O2室温孵育10min，PBS洗5min×3次；正常山羊血清封闭，37℃孵育30min，倾去血清，勿洗；滴加一抗工作液，37℃孵育1－2h，PBS洗5min×3次；滴加适量生物素标记二抗工作液，37℃孵育30min，PBS洗5min×3次；滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育15min，PBS洗5min×3次；DAB显色5－10min；蒸馏水冲洗，脱水，透明，封片。OLYMPUS光学显微镜（BX51，Japan）摄片。

4．图像分析及统计学处理

采用Image－Pro Plus 6．0图像分析软件计算细胞GRP78表达的平均光密度，每个蜡块切两张切片，每张切片随机取3个高倍镜视野（×400），每个视野完整并且不重叠。计算每个视野中的CHOP阳性细胞数，拍摄方法同上。数值均以均数±标准差（mean±SD）表示，统计比较用SPSS 17．0软件进行，计量资料采用方差分析和t检验。

结 果

1．附睾组织病理学

对照组输出小管由柱状纤毛细胞和和无纤毛细胞构成。各管腔内有大量染色均匀的精子；附睾管主细胞排列紧密、整齐、细胞形态呈高柱状，胞质比较饱满，细胞核排列整齐有序，细胞靠近腔面有大量的纤毛，游离面边缘整齐（图1A）。高脂饮食组输出小管管壁变薄，管腔增大纤毛变短，管腔内的精子明显减少；附睾管退行变，管壁变薄，上皮细胞胞质疏松，纤毛缩短、稀疏、结构不清，游离面边缘模糊；（图1B）。MT处理组输出小管和附睾管结构正常（图1C）。

2．免疫组化结果

2．1GRP78蛋白

GRP78主要表达于附睾上皮细胞胞质，阳性产物呈棕黄色颗粒。在对照组的附睾管和输出小管上皮GRP78蛋白呈较弱表达，主要分布于近管腔胞质（图2A）。高脂饮食小鼠附睾管和输出小管上皮细胞GRP78的表达上调，在近管腔侧和基底部的胞质都有表达（图2B）。MT处理组小鼠附睾管和输出小管上皮GRP78表达下调，主要分布于近管腔胞质（图2C）。GRP78表达的平均光密度结果见表1。

2．2CHOP蛋白

CHOP主要表达于附睾上皮细胞胞核。对照组小鼠附睾管和输出小管中，仅见少数细胞的细胞核有CHOP蛋白表达（图3A）；高脂饮食组小鼠附睾管中，较多细胞CHOP蛋白呈阳性表达，输出小管中阳性细胞则较少（图3B）；MT处理组小鼠附睾管和输出小管，只有少数细胞核有CHOP蛋白的表达（图3C）。CHOP阳性细胞数结果见表1。

图3 小鼠附睾CHOP阳性细胞。3A对照组；3B高脂饮食组可见较多的CHOP阳性细胞；3CMT处理组。SABC×400．标尺＝25μmFig．3ACHOP－positive cells in mice epididymis．3A：control mice．3B：more CHOP－－positive cells were seen in high－fat diet mice．3C：mice fed on high－fat diet with additional melaton in treatment．SABC ×400．Bar＝25μm

表1 GRP78和CHOP在附睾中的表达（n＝6，mean±SD）Table 1 Expression of GRP78and CHOP in the epididymis

讨 论

精子发生最终产生的是一个高度分化的细胞——精子。然而，睾丸中产生的精子是不成熟的，只有经历附睾和女性生殖道的睾丸后成熟才具备使卵细胞受精的能力［7］。高达40%的男性不育是由于精子成熟紊乱所造成的，附睾微环境的改变势必会影响精子的成熟，使得了解附睾的功能和精子的成熟变得尤为重要［8］。

内质 网 应 激 （endoplasmic reticulum stress，ERS）是由于内质网稳态被打乱形成诸如错误折叠蛋白质聚集、Ca2＋耗竭和脂质合成紊乱等，通过相应的信号通路，引发细胞内一系列的反应。GRP78是内质网中一种特异的分子伴侣，属于热休克蛋白70家族，在精母细胞和圆形精子细胞以及附睾上皮细胞中都有表达，它能帮助蛋白质进行正确的折叠，在精子发生过程中和精子的功能中起作用，例如使卵子受精等［9］。但是GRP78表达上调也可导致ERS，引起细胞损伤［10］。研究表明，高脂饮食引起卵母细胞、胰腺β细胞凋亡增加均有ERS的参与［11，12］，ERS 也 参 与 了 铬 引 起 的 睾 丸 损 伤［13］。 本研究发现，GRP78蛋白在高脂饮食小鼠输出小管及附睾管上皮细胞呈表达上调，可能会激活ERS，造成附睾内环境紊乱，影响精子的成熟。

CHOP／GADD153是ERS的下游蛋白，在细胞应激状态下，PERK、ATF6和IRE1内质网调控通路诱导CHOP基因的转录，CHOP蛋白增加并聚集在细胞核内。Gong等研究发现［14］，在壬基苯酚诱导的睾丸间质细胞的ERS中，CHOP基因表达显著增加。CHOP的过度表达促进细胞凋亡发生［15］。MCCullough证实［16］CHOP表达增加可以通过下调抗凋亡蛋白Bcl－2而引起细胞的凋亡。本研究结果显示，CHOP蛋白在正常对照组和褪黑素处理组中仅有少量表达，而高脂饮食小鼠附睾CHOP阳性细胞数明显增多，表明转录因子CHOP被活化，提示高脂饮食时附睾上皮细胞发生ERS，通过凋亡途径对其产生损害。

MT作为一种强抗氧化剂，可以抑制线粒体氧化应激引起的细胞凋亡［17］。有研究表明，MT可以通过抑制脂质过氧化和增加抗氧化能力途径，改变阿霉素对睾丸毒性损伤［18］。Ji等发现［19］，MT 可以降低镉引起的睾丸组织中内质网应激蛋白GRP78和CHOP的表达，从而对睾丸起到保护性作用。本实验研究发现，MT处理的小鼠与高脂饮食小鼠相比，附睾形态结构完整，GRP78、CHOP蛋白的的表达明显下调，提示MT对附睾的保护作用可能是通过抑制GRP78、CHOP的活化，降低ERS状态，从而改善高脂饮食引起的附睾损伤。

综上所述，本实验通过高脂饲料喂养小鼠，研究发现高脂饮食可以通过GRP78与CHOP通路的激活而引起附睾的损伤。MT减轻高脂饮食引起的附睾损伤，可能是通过阻止ERS的激活实现的。这为特发性不育症的治疗提供了新的思路，但具体机制还有待进一步研究。

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