酸碱结合预处理对水稻秸秆纤维素乙醇转化率的影响

段晓健，居学海，张长波，王景安，刘仲齐

（1.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387；2.农业部环境保护科研监测所，天津300192）

木质纤维素是世界上唯一可再生且含量丰富的可利用资源［1］，由木质纤维素制得的乙醇因其对环境的有益影响，作为石油等燃料的替代能源越来越受到关注［2］。由木质纤维素生产乙醇需要将其中的纤维素转化为易被水解的单糖。研究表明，木质纤维素中的木质素含量及晶体结构是影响生物质原料水解的关键因子，已有多种物理、生物及化学方法可以提高水解效率［3］。其中物理法能耗高，生物法时间长且效率低，而化学预处理方法主要是采用稀酸、稀碱、有机溶剂等方法进行处理，使用广泛，在低能耗条件下的木质素去除中发挥了重要作用。NaOH［4－6］、H2O2［7］等小分子物质在常温常压下能够有效去除木质素，稀酸［7－12］能有效地去除半纤维素，从而提高纤维素和酶的比表面积和降解效率。酸碱结合处理往往比单一处理更有效，如乙酸－过氧化氢（PAA）预处理是一种低能耗、有效氧化木质素的方法，而碱的使用可以大幅减少预处理过程中PAA的用量［8］，因此，将氢氧化钠与PAA结合能大幅提高甘蔗渣的还原糖产率和乙醇转化率［9］。

水稻秸秆资源极其丰富，年产量达到650×106～975×106t，且其木质素含量低（5%～15%），是产乙醇的优良原料。但水稻秸秆的纤维素部分由于木质素与纤维素、半纤维素间固有的复杂结构而难以被酶水解，如何有效去除木质素仍然是水稻秸秆发酵产乙醇过程中的难题。

作者以水稻秸秆为原料，对6种不同的化学预处理方法在温和条件下的木质素去除效果以及纤维素乙醇转化效率进行了比较，拟为探索低成本的木质素去除方法提供参考。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

水稻秸秆，自然风干后用实验粉碎机粉碎后过筛，取20～40目，备用。水稻的木质纤维素构成：半纤维素24.09%，纤维素35.89%，木质素5.28%。

纤维素酶（原产日本，酶活为10 000U·g－1），北京鼎国公司；酵母，安琪酵母公司；衍生化试剂，色谱纯，Sigma公司。所用试剂均为分析纯。

万能粉碎机，控温摇床，水浴锅，Agilent GC－MS联用仪。

1.2 方法

1.2.1 水稻秸秆预处理

1.2.1.1 1%乙酸处理

将水稻秸秆与体积分数为1%的乙酸以质量体积比1∶100（g∶mL，下同）浸泡2h后，在－20℃处理2 h，然后室温融化1h。水洗至pH值为中性，去除多余水分，重复3次，获得残渣样品，烘干称重后保存备用。

1.2.1.2 5%过氧化氢处理

将水稻秸秆与体积分数为5%的过氧化氢以质量体积比1∶100室温浸泡24h。水洗至pH值为中性，去除多余水分，重复3次，获得残渣样品，烘干称重后保存备用。

1.2.1.3 15%PAA处理

PAA的配制：取1.5BV的乙酸，加1BV的30%（质量分数）过氧化氢，加入1.5%硫酸作为催化剂，在室温下放置72h。

将30g水稻秸秆与PAA以质量体积比1∶10室温浸泡24h后，在75℃的水浴锅中保温3h。水洗至pH值为7.0，重复3次，获得残渣样品，烘干称重后保存备用。

1.2.1.4 氢氧化钠－PAA处理

（1）将水稻秸秆与10%氢氧化钠按质量体积比1∶100分别于室温浸泡24h和48h。水洗至pH值为中性，去除多余水分至含水量约70%，按质量体积比1∶1加入15%PAA，在75℃的水浴锅中保温3h，水洗至pH值为7.0，重复3次，获得残渣样品，烘干称重后保存备用。

（2）将水稻秸秆与5%氢氧化钠按质量体积比为1∶3在90℃水浴锅中保温1.5h。水洗至pH值为7.0，去除多余水分后，按质量体积比1∶1加入15%PAA，在75℃的水浴锅中保温3h，水洗至pH值为7.0，重复3次，获得残渣样品，烘干称重后保存备用。

1.2.2 水稻秸秆的异步发酵

在100mL锥形瓶中加入1g预处理过的水稻秸秆，以pH值4.8的醋酸－醋酸钠缓冲溶液作为异步发酵体系（固液比为1∶20），分别加入350U的纤维素酶，在210r·min－1、50℃的条件下酶解，每隔2h取样测定葡萄糖浓度。72h后，向其中加入已活化的酵母2mL，24h后取样测定乙醇体积分数。以未处理的水稻秸秆作为对照。

1.2.3 分析与检测

葡萄糖浓度采用GC－MS方法测定。

乙醇体积分数采用GC方法测定。

葡萄糖产量和固体得率按下式计算：

2 结果与讨论

2.1 不同预处理方法的固体得率和葡萄糖产量

表1 不同预处理方法的固体得率和葡萄糖产量Tab.1 The solid yield and glucose production for different pretreatment methods

固体得率在一定程度上可以反映木质素的去除率，一般和木质素的去除率呈负相关［10］。由表1可知，1%乙酸和5%过氧化氢预处理的固体得率都大于70%，其葡萄糖产量远远低于其它预处理方法，表明固体得率高的预处理方法不能有效地去除木质素，部分纤维素仍然被木质素缠绕，不能被酶充分水解；10%氢氧化钠－PAA浸泡处理的固体得率最低，约为21%，但其葡萄糖产量也并没有显著高于固体得率在40%～50%间的两个处理，这说明固体得率较低的预处理方法可能使纤维素被部分溶解掉，导致葡萄糖产量较低，这和柳枝稷上的研究结果一致［11］。由此可见，预处理过程中的固体得率可以较好地反映预处理的效果，但固体得率过低也会影响葡萄糖产量，因此，致力于研究既能有效去除木质素又不损失纤维素的化学预处理方法更有现实意义。

2.2 乙酸与过氧化氢预处理效果的比较（图1）

由图1可知，经1%乙酸、5%过氧化氢预处理过的水稻秸秆和未处理的水稻秸秆，在纤维素酶作用的最初阶段，其葡萄糖浓度均呈指数升高，在36h时达到峰值。反应体系中的葡萄糖浓度在处理和对照之间没有显著差异，说明这两种预处理方法不能有效地破坏木质纤维素的结构。这和已报道的水稻秸秆用乙酸冷冻处理［12］、甘蔗渣［7］和竹竿［5］用过氧化氢常温处理的结果有所不同，说明预处理的效果和所选择的生物质材料的类型及木质纤维素的内部结构也有很大关系［13］。

图1 乙酸及过氧化氢预处理对葡萄糖浓度的影响Fig.1 The effect of pretreatment with acetic acid and hydrogen peroxide on the concentration of glucose

2.3 氢氧化钠－PAA与PAA预处理效果的比较（图2）

图2 氢氧化钠－PAA与PAA预处理对葡萄糖浓度的影响Fig.2 The effect of pretreatment with sodium hydroxide－PAA and PAA on the concentration of glucose

由图2可知，酶解4h左右，预处理的水稻秸秆和未经处理的水稻秸秆的葡萄糖浓度基本相等，在12h前都呈指数升高；随着酶解时间的延长，12h后，经氢氧化钠－PAA和PAA预处理过的水稻秸秆的葡萄糖浓度迅速上升，远高于对照，一直持续到24h后，纤维素水解速度才开始减慢，且不同处理间葡萄糖浓度的差异越来越明显。说明不管PAA单独作用还是和NaOH共同作用，酸和碱都破坏了水稻秸秆木质纤维素的结构。碱可以润胀纤维素，乙酸可以溶解半纤维素、氧化木质素，都不同程度地使木质素得到了氧化，减弱了它们之间结合的作用力，增大了纤维素酶和纤维素的作用面积。4种方法SPAA－48、SPAA－24、SPAA、PAA的木质素去除率分别为79%、78%、59%、50%，水解72h后的葡萄糖浓度分别约为17 mg·mL－1、13mg·mL－1、18mg·mL－1和14mg·mL－1。其中最佳的预处理方法为SPAA，这种方法不仅对甘蔗渣有良好的木质素去除效果［9］，而且对水稻秸秆也具有良好的木质素去除效果，并能显著提高纤维素水解率和乙醇转化率。研究还发现，用10%氢氧化钠－PAA在室温下浸泡48h与用5%氢氧化钠－PAA 90℃处理1.5h具有同样的效果，浸泡24h的处理效果较浸泡48h的处理效果差，说明延长室温浸泡时间有利于氢氧化钠－PAA作用于木质素，更有效地润胀纤维，从而提高水稻秸秆酶解的葡萄糖浓度，也说明木质素的去除过程可以在更温和的条件下进行。

本研究采用的温和处理条件，和以往的高温、高压处理方法相比，更利于节约资源。

2.4 不同预处理方法的乙醇得率

乙醇得率（本研究以乙醇体积分数表示）和预处理方法有直接的关系，也和葡萄糖浓度密切相关。不同预处理方法的乙醇得率见表2。

表2 不同预处理方法的乙醇得率Tab.2 The ethanol yield for different pretreatment methods

由表2可知，乙醇体积分数和葡萄糖浓度密切相关，它们之间的线性相关系数达到极显著水平（R＝0.987）。说明提高乙醇得率的关键在于提高葡萄糖浓度，但也和选择的预处理方法有一定的联系，如经15%PAA处理的葡萄糖浓度为14.059mg·mL－1，高于SPAA－24处理的葡萄糖浓度12.558mg·mL－1，但其乙醇得率差异不显著（P＞0.05）；SPAA－48处理的葡萄糖浓度和SPAA处理的葡萄糖浓度差异不显著（P＞0.05），但其乙醇体积分数差异显著（P＜0.05），说明乙醇得率和预处理方法的选择也有一定关系，如过长的预处理时间会使糖变为糖醛或降解，导致乙醇得率下降［14］。SPAA预处理效果最好，乙醇得率最高，表明酸碱结合处理能有效去除水稻秸秆中的木质素，大幅提高纤维素水解率和乙醇转化率。由表2还可知，1%乙酸和5%过氧化氢处理的葡萄糖浓度和乙醇得率均低于对照。有研究表明稀酸可以通过溶解半纤维素和润胀纤维素的结构来提高纤维素酶的酶解效率，但其更适于硬木种类，对软木种类效果较差［15］。本实验表明，稀酸对禾本科植物水稻秸秆的作用也甚微，对水稻秸秆木质纤维素的结构没有影响。

3 结论

采用6种不同的化学预处理方法对水稻秸秆进行预处理脱除木质素。结果表明，稀酸及弱碱即1%的乙酸和5%的过氧化氢对水稻秸秆的木质素去除效果不明显，不能有效地提高葡萄糖浓度；而氢氧化钠－PAA的复合去除作用良好，显著提高了葡萄糖浓度和乙醇得率；用氢氧化钠－PAA室温浸泡处理水稻秸秆可以替代氢氧化钠－PAA高温处理水稻秸秆，两者都可以较好地去除木质素，同时润胀纤维，提高纤维素酶的作用面积；乙醇得率和葡萄糖浓度呈正相关，但也和预处理方法有一定联系。

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