深海枝芽胞杆菌A493产生的新活性物质Z11的抗菌机理

黄 典，陈 莉，邵宗泽，孙风琴，张少博，林 达，张鼎楠，喻子牛，张吉斌

（1.华中农业大学 农业微生物学国家重点实验室 生命科学技术学院 微生物农药国家工程研究中心，湖北 武汉430070；2.国家海洋局第三海洋研究所 海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门361005）

细菌病害是一类重要的植物病害，每年都造成重大的农作物产量和经济损失。目前，防治植物细菌病害主要以化学防治为主、生物防治为辅，但由于农业生产过程中化学农药的过量使用，其产生的各种问题诸如对环境、人类健康和非靶标生物的危害等，使得化学防治受到很大的限制［1，2］。因此，植物细菌病害的生物防治越来越受到人们的关注［3－6］。目前国内外主要利用陆地微生物来进行植物细菌病害的防治工作，利用海洋微生物的相关报道不多。

研究者从深海分离得到一株枝芽胞杆菌（Virgibacillus dokdonensis）A493，其产生的新活性物质Z11经初步鉴定为新型的氨基糖苷类化合物，对植物细菌水稻黄单胞菌有较强拮抗效果。作者在此以水稻黄单胞菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）为研究对象，研究新活性物质Z11对水稻黄单胞菌生理、生化方面的影响，了解其抗菌机理，拟为生物农药的开发奠定理论基础。

1 实验

1.1 菌种来源

水稻黄单胞菌，由华中农业大学农业微生物学国家重点实验室菌种保藏中心（CCAM）提供；深海枝芽胞杆菌A493（MCCC1A00493），由国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室邵宗泽研究员鉴定并提供。

1.2 培养基

海洋细菌培养基（2216E）：蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉浸粉1g，乙酸钠1g，硝酸铵0.2g，柠檬酸钠0.5g，柠檬酸铁0.1g，人工海水定容至1L，终pH＝7.6±0.2。

人工海水配方：氯化钠19.45g，氯化镁0.75g，硫酸镁0.75g，氯化钙1g，氯化钾0.55g，碳酸氢钠0.16g，溴化钾0.08g，氯化锶34mg，硼酸22mg，硅酸钠4mg，氟化钠2.4mg，磷酸氢二钠8mg，氯化锰0.5mg，硫酸铜0.5mg，硫酸锌10mg，纯水定容至1L。

水稻黄单胞菌培养基（协本氏培养基PSA）：马铃薯300g，蔗糖15g，十二水合磷酸氢二钠2g，四水合硝酸钙0.5g，蛋白胨5.0g，蒸馏水1L。相应固体培养基按1.5%～2.5%琼脂粉配制。

1.3 仪器

高速离心机，超净工作台，恒温摇床，冷冻离心机，超声破碎仪，紫外分光光度计，DU730型核酸蛋白分析仪，DDS－801A型电导仪，Waters高效液相色谱仪，C18色谱柱（4.6mm×250mm），50μL进样针。

1.4 方法

1.4.1 活性物质Z11对水稻黄单胞菌生长的影响

取处于对数生长期的水稻黄单胞菌细胞，按1%接种量接种于5mL PA瓶中，设置7个浓度梯度，分别加入活性物质Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40μL、80μL、160μL，终浓度（μg·mL－1）分别为0、14、28、56、112、224、448；于28℃、180r·min－1恒温振荡培养24h；再于4℃、8000r·min－1离心30min，收集沉淀；用生理盐水洗涤3次后，离心，将沉淀用等体积生理盐水悬浮，测定其OD600值。检测不同浓度活性物质Z11作用下的水稻黄单胞菌生长情况。

1.4.2 活性物质Z11对水稻黄单胞菌蛋白质合成的影响

取处于对数生长期的水稻黄单胞菌细胞，按1%接种量接种于5mL PA瓶中，设置5个浓度梯度，分别加入活性物质Z11 0μL、5μL、10μL、20μL、40 μL，终浓度（μg·mL－1）分别为0、14、28、56、112；于28℃、180r·min－1恒温振荡培养24h；再于4℃、8000r·min－1离心30min，收集沉淀；用生理盐水洗涤3次后，离心，将沉淀用等体积生理盐水悬浮，测定其OD600值；取1.5mL菌悬液经冰浴超声波（300W）破碎菌体（3min，每次3s，间隔3s），于3000r·min－1离心30min；取上清液在核酸蛋白分析仪上测定280nm和260nm处的吸光度。按下式计算蛋白质浓度：

蛋白质浓度（mg·mL－1）＝1.45OD280－0.74OD260（1）

1.4.3 活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞膜通透性的影响

取对数生长期细胞培养液2mL，于8000r·min－1、4℃离心30min，收集沉淀，用ddH2O洗涤沉淀3次，再用0.9%NaCl悬浮至5mL，分别加入活性物质Z11 0μL、5μL、10μL、20μL，终浓度（μg·mL－1）分别为0、14、28、56，充分摇匀，作用0min、30min、60 min、90min、120min、150min后测定其电导率。

1.4.4 活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞壁合成关键酶的影响

以尿苷三磷酸（UTP）和N－乙酰葡糖胺－1－磷酸（GlcNAc－1－P）为反应底物，在水稻黄单胞菌细胞壁合成关键酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰转移酶（GlmU）的催化作用下生成尿苷二磷酸－N－乙酰葡糖胺（UDP－GlcNAc），通过HPLC检测活性物质Z11加入前后反应的产物量即可计算酶活抑制率，以反映活性物质Z11对GlmU酶的抑制效果。

反应体系：15μL Buffer（50mmol·L－1Tris－HCl、10mmol·L－1MgCl2、1mmol·L－1DTT）、10μL 2mmol·L－1UTP和10μL 2mmol·L－1GlcNAc－1－P作为反应底物、2μL活性物质Z11作为抑制剂、5μL GlmU酶最后加入。在37℃反应10min后，于沸水中煮10min终止反应；然后于12 000r·min－1离心5min；反应混合物以20mmol·L－1、pH值为5.0的三乙胺醋酸（TEAA）＋0.35%甲醇为流动相，流速1mL·min－1，室温下分离底物和产物，检测波长为254nm，进样量为20μL。实验重复3次，记录HPLC谱图中产物峰面积，按下式计算酶活抑制率：

式中：S0、S1分别为加入活性物质Z11前后产物的峰面积。

2 结果与讨论

2.1 活性物质Z11对水稻黄单胞菌生长的影响（表1）

表1 活性物质Z11对水稻黄单胞菌生长的影响Tab.1 The effect of active substance Z11on growth of X.oryzae pv.oryzae

由表1可看出，在不同浓度活性物质Z11作用下，菌体OD600值之间存在显著差异，说明活性物质Z11能够显著影响水稻黄单胞菌的生长。一定浓度范围内，随着活性物质Z11浓度的增大，OD600值减小，菌体浓度降低，菌体生长受到抑制；当活性物质Z11浓度达到56μg·mL－1之后，可以直接杀死水稻黄单胞菌。

2.2 活性物质Z11对水稻黄单胞菌蛋白质合成的影响（表2）

表2 活性物质Z11对水稻黄单胞菌蛋白质合成的影响Tab.2 The effect of active substance Z11on protein synthesis of X.oryzae pv.oryzae

由表2可看出，在不同浓度活性物质Z11作用下，菌体蛋白质浓度之间存在显著差异，说明活性物质Z11能够影响水稻黄单胞菌蛋白质的合成。在抑制菌体生长的浓度范围内，随着活性物质Z11浓度的增大，蛋白质浓度不断减小，当活性物质Z11浓度超过56μg·mL－1后，蛋白质的合成几乎停止。

2.3 活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞膜通透性的影响（表3）

表3 活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞膜通透性的影响Tab.3 The effect of active substance Z11on cell membrane permeability of X.oryzae pv.oryzae

由表3可知，在不同浓度活性物质Z11作用下，随着处理时间的延长，电导率的变化趋势一致，菌体电导率值之间没有显著性差异。说明活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞膜通透性没有影响。

2.4 活性物质Z11对水稻黄单胞菌细胞壁合成关键酶的影响

催化反应底物和产物的高效液相色谱见图1。

图1 催化反应底物和产物的高效液相色谱Fig.1 The HPLC spectrum of substrate and product in the catalytic reaction

由图1数据计算，加入活性物质Z11前后产物的峰面积分别为928386.7±32046.7、744613.3±34679.1，活性物质Z11对GlmU酶的抑制率为（19.74±3.55）%。表明活性物质Z11对GlmU酶存在一定抑制效果，GlmU酶蛋白可能为潜在靶标之一。

2.5 讨论

深海枝芽胞杆菌A493所产抗菌活性物质Z11为一种新型的氨基糖苷类活性物质，前期研究显示活性物质Z11耐酸碱、耐高温、性质稳定、抗菌谱窄，推测其抗菌机理具有特异性，本研究结果显示新活性物质Z11并不改变病原菌细胞膜的通透性能，但是能够明显影响病原菌蛋白质的合成，可能在病原菌核糖体内存在其相应的作用靶标。

肽聚糖是细菌细胞壁的主要组成部分，如果肽聚糖的生物合成受阻，细菌细胞壁的合成必定会受到影响。UDP－GlcNAc作为肽聚糖和脂多糖生物合成的一种必需的细胞质前体［7－9］，是细菌细胞壁合成所必需的。GlmU酶具有乙酰基转移酶活性和尿嘧啶转移酶活性，是UDP－GlcNAc生物合成途径中的关键酶，GlmU酶受到抑制将直接导致细菌细胞壁合成受阻而死亡［10］，HPLC法测定水稻黄单胞菌GlmU酶活性是根据核苷酸糖类在254nm处有特征吸收峰，而且不同的核苷酸糖在以三乙胺醋酸为流动相时的保留时间不同而成功分离底物GlcNAc－1－P、UTP以及产物UDPGlcNAc［11］，为水稻黄单胞菌中潜在靶标蛋白的寻找和验证提供了一种准确、简单、可行的方法。

3 结论

以一株抗菌谱窄的深海枝芽胞杆菌（Virgibacillus dokdonensis）A493为研究对象，对其产生的新的氨基糖苷类抗菌活性物质Z11抑制水稻黄单胞菌的浓度范围和抗菌作用机理进行了研究。结果表明：Z11抑制水稻黄单胞菌的浓度范围为14～56μg·mL－1；活性物质Z11不改变水稻黄单胞菌细胞膜通透性，但能影响其蛋白质的合成和细胞壁合成关键酶N－乙酰葡糖胺－1－磷酸尿苷酰转移酶（GlmU）的活性，从而影响其细胞壁的合成及其完整性。研究结果说明活性物质Z11对水稻黄单胞菌的作用机制是多方面的，但是，明确其抗菌分子机制还需要进一步深入研究。

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