体外微核试验重要影响因素研究

管 莹，高 茜，朱洲海，米其利，李雪梅，缪明明，夭建华

（云南烟草科学研究院，云南 昆明650106）

微核试验检测终点明确，且方法简便，易于开展，是遗传毒性标准组合试验之一。在食品、医药产品、工农业产品等与健康相关产品的安全评价、遗传损害的监测、特定人群的突变损伤检测和早期预报等方面得到了广泛的应用［1－4］。近30年来，以减少（Reduction）、优化（Refinement）和替代（Replacement）为核心的3R理论已愈来愈多地被国际社会所接受，利用体外微核试验对物质的毒性进行筛查，可有效地减少动物的使用量，是当今毒性测试发展的主要趋势。体外微核试验多采用哺乳动物细胞，为有核细胞，有核细胞微核的判定标准目前尚属空白，对其的判定多借鉴《食品安全性毒理学评价程序》（以下简称标准1）［1］和《新药临床前安全性评价与实践》（以下简称标准2）［5］，这两种判定标准均是基于骨髓细胞微核试验，骨髓细胞微核试验采用的是嗜多染红细胞，无核，微核明显，容易观察和判定。故对有核细胞的微核判定标准进行深入研究十分必要。

除此之外，体外微核试验采用离体培养的细胞，完全脱离了整体稳态和内分泌调控，其结果的稳定性在很大程度上依赖于受试细胞本身，细胞自身的状态对试验结果的稳定性具有重要影响。

因此，作者对已发现的影响微核试验结果的关键因素判定标准和细胞连续传代代次进行了深入研究，以期为提高哺乳动物细胞体外微核试验结果的可重复性及可比性提供参考。

1 实验

1.1 主要试剂与仪器

DMEM／F12、LHC－8细胞培养基，Invitrogen公司；胎牛血清，GIBCO公司；PBS、胰蛋白酶、细胞松弛素B，Sigma公司；环磷酰胺；甲醇（分析纯）；Giemsa染料；二甲基亚砜（DMSO，细胞培养级）。

6孔细胞培养板，Corning公司；超净工作台、CO2培养箱，Forma公司；离心机；显微镜；SM450型自动吸烟机。

1.2 方法

1.2.1 细胞的传代培养

按常规方法消化CHO细胞，制成单细胞悬液，调节细胞密度，接种到细胞培养瓶中，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，计为第1代细胞；待细胞汇合率达到80%时，按1∶4比例传代，汇合率再次达到80%时计为第5代细胞；以此类推，连续传代至第17代。

1.2.2 卷烟烟气样品的制备

按国标方法［6］，利用自动吸烟机抽吸20支标准测试用卷烟3R4F，用直径92mm的剑桥滤片捕集燃吸后产生的烟气总粒相物（TPM），称重并计算TPM的量；将剑桥滤片放入三角瓶中，加入适量DMSO，置于超声仪上超声20min；用无菌滤纸过滤，收集TPM提取液，调节TPM在DMSO中的终浓度为10mg·mL－1；将样品分装后于－80℃储存待用。

1.2.3 哺乳动物细胞体外微核试验

按常规方法消化CHO细胞，制成单细胞悬液，以细胞计数仪计数后，将CHO细胞稀释至5×104个·mL－1，接种于6孔细胞培养板中，每孔2mL；将培养板置于37℃、5%CO2培养箱内，培养24h；每批试验设空白对照组、DMSO溶剂阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组、样品组，其中样品组分别设定1／2IC50、1／4 IC50、1／8IC50、1／16IC504个浓度（IC50值由中性红细胞毒性试验测定）；移除培养板中的培养基，将配制好的空白对照、阴性对照、阳性对照和不同浓度TPM样品溶液添加到培养板中，每孔2mL，同时加入细胞松弛素B溶液，终浓度为6μg·mL－1；将培养板在CO2培养箱中培养24h；用胰蛋白酶溶液将细胞从培养板的表面消化下来；低渗后滴片；用新配制的Giemsa染液染色15min，自来水冲洗、风干，在普通光学显微镜下观察1000个双核细胞，计数微核的数量，计算微核率。

1.2.4 统计学分析

利用统计学软件SPSS，选择双样本t－test方法对不同处理试验组微核率之间是否有显著性差异进行检验。

2 结果与讨论

2.1 判定标准对受试物微核率的影响

以CHO细胞为受试细胞，对参比卷烟3R4F的TPM在1／2IC50、1／4IC50、1／8IC50、1／16IC504个剂量下的微核率进行检测，分别参照标准1和标准2进行显微镜镜检，结果如图1所示。

图1 不同判定标准对诱发CHO细胞微核率计数结果Fig.1 Micronucleus rate of CHO cells according to different scoring criteria

由图1可知，随着受试剂量的增大，受试物的平均微核率呈上升趋势，依据两种判定标准对同一受试物不同剂量下的微核率计数结果均有显著差异（P＜0.05），但剂量－微核率总体趋势较为一致。这主要是由于标准1和标准2对微核的相对大小判定有所差异，标准1规定微核直径为细胞直径的1／20～1／5［1］，标准2规定小者如针尖，大者可达细胞直径的1／3～1／2［5］。标准2对微核大小判定范围较标准1宽，以其为判定准则对同一受试物诱发细胞微核率计数结果较高。由此可见判定标准对受试物诱发细胞微核率存在直接影响。此外，目前微核试验主要依靠人工显微镜镜检，微核判定还存在着主观差异［7］。因此，统一微核判定标准对提高体外微核试验的可重复性及可比性是十分重要的。

由于两种判定标准均是基于骨髓细胞微核试验，属于体内微核试验，与本研究采用的CHO细胞体外微核试验在试验方法和细胞株的选择上有所差异。通常体外微核试验采用细胞分裂阻滞微核（Cytokinesisblock micronucleus，CB－MN）分析技术，计数一次核分裂后双核细胞中的微核数，提高了微核识别的准确性。虽然CHO细胞为OECD哺乳动物体外微核试验指导文件［8］中推荐使用的细胞株，但未对其微核大小有明确规定。研究人员应根据受试物的特性选择适用判定标准。

2.2 细胞连续传代代次对受试物微核率的影响

分别取第1、5、9、13、17代CHO细胞为受试细胞，对参比卷烟3R4F的TPM的平均微核率进行检测，参照标准1进行微核率计数，结果如图2所示。

图2 不同代次CHO细胞体外微核率计数结果Fig.2 In vitro micronucleus rate of different passages CHO cells

由图2可知，随着细胞代次的升高，受试物平均微核率呈上升趋势，第1代、第5代、第9代3个试验组的微核率较为一致（P＞0.05），但与第13代和第17代2个试验组的微核率有显著差异（P＜0.05）。这表明，连续传代9代以内的CHO细胞的微核率较为一致。

2.3 讨论

细胞的状态也是影响微核率的重要因素之一。有研究对多种癌细胞株与正常细胞株的微核率进行比较，发现癌细胞株微核率明显高于正常细胞株［9］。正常细胞株经过长期培养后可自然癌化［9］，以老化的细胞作为检测细胞必然会导致结果的假阳性率升高。

3 结论

由于判定标准选用的不同会导致体外微核试验结果出现显著差异，为了提高体外微核试验结果的可重复性以及可比性，研究人员应根据受试物的特性选择合适的判定标准；其次，应保证用于体外微核试验的细胞状态的稳定，CHO细胞连续传代代次控制在9代以内为佳。

［1］GB 15193－2003，食品安全性毒理学评价程序［S］.

［2］GB 15670－1995，农药登记毒理学试验方法［S］.

［3］YY／T 0127.12－2008，牙科学 口腔医疗器械生物学评价 第2单元：试验方法 微核试验［S］.

［4］SN／T 2178－2008，危险品哺乳动物红细胞 微核试验方法［S］.

［5］袁博俊，王治乔.新药临床前安全性评价与实践［M］.北京：军事医学科学出版社，1997：102－108.

［6］GB／T 19609－2004，卷烟用常规分析用吸烟机测定总粒相物和焦油［S］.

［7］闫学昆，陈英，杜杰，等.CB微核法图像自动分析技术研究进展［J］.辐射防护通讯，2008，28（5）：9－14.

［8］OECD Guideline for the testing of chemicals draft proposal for a new guideline 487：In vitro mammalian cell micronucleus test（MNvit）［S］.

［9］唐剑云，王相智，何博，等.不同类型细胞株的微核出现率［J］.安徽师范大学学报（自然科学版），1983，（1）：80－83.