TNF及其受体在退变椎间盘组织中的表达及意义

杨德强 高 扬 蔡国栋 周 磊 王 增 王俊勤 秦玉清

(1.泰山医学院，山东 泰安 271016；2. 泰山医学院附属医院，山东 泰安 271000)

LDH是骨科中常见病、多发病，是引起腰腿痛最常见的原因之一,其确切病因目前尚无确切报道，但许多研究表明它与椎间盘的退变密切相关，因此从各个角度研究椎间盘的退变对于防治腰椎间盘突出显得尤为重要。目前对于椎间盘突出后TNF-α对根性疼痛的研究比较多，而在椎间盘退变中的意义研究的较少。本实验以退变的椎间盘作为研究对象，通过对肿瘤坏死因子及其受体定量表达和量值变化的研究，探讨其在退变椎间盘组织中的表达及规律，与腰腿痛及根性坐骨神经疼痛程度的关系，从免疫学和生物化学角度研究椎间盘退变的病因和病理机制，为扭转和修复退变椎间盘组织提供实验依据，有助于探寻抑制细胞凋亡人工合成细胞因子，期望延迟或阻断这一病理过程。

1 资料与方法

1.1研究对象与分组

实验组：椎间盘标本取自泰医附院2011～2013年内确诊的LDH手术患者，每个标本均包括髓核、纤维环和一部分软骨终板。经病理学检查证实为退变的椎间盘组织，共40例，男25例，女15例。平均年龄42.5岁(最大者72岁，最小者18岁)：术中病理分型：脱垂游离型12例，突出型28例。

对照组：标本取自外伤后致腰椎爆裂骨折手术患者，术前证实无腰椎疾患，病理学证实所取标本为正常椎间盘组织，共搜集10例。男7例，女3例，年龄在17～45岁，平均年龄32.6岁。

1.2标本的收集、存放、处理

对照组共10例，均取自腰椎爆裂骨折手术患者，病理学证实为正常椎间盘组织。实验组标本取自椎板切开减压髓核摘除术患者，术中尽可能完整摘除突出组织，并仔细分辨出椎间盘的不同部分。所有组织切除后30分钟送到实验室，用生理盐水反复冲洗3遍，洗净上面的血液，用蔗糖进行脱水后，放入-80℃的冰箱中保存备用。

1.3研究方法：

对所选取的标本进行分组：实验组40例，均为初次发病的腰椎间盘突出症手术患者，年龄在18～60岁之间；对照组10例，取自无椎间盘突出症因外伤至腰椎爆裂骨折需要椎管减压手术患者，年龄20～40岁之间，选取标本中含有不同比例的纤维核、髓核及少量的软骨终板。应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测TNF-α、TNF-β以及sTNFR1,sTNFR2的浓度；用逆转录一聚合酶链式方法(RT-PCR)法检测靶细胞膜表面TNFR1/R2mRNA的表达。然后用SPSS16.0统计学软件进行数据处理，计算出各指标的标准差和均数，分析总体差异和各组差异。并对实验组的TNF-α的含量与其临床表现的结果进行比较分析，并运用统计学软件进行统计分析。

1.4统计学方法、处理

2 结 果

2.1组织TNF-α、TNF-β的标准曲线的建立(见图1、图2)。

表1 对照组与实验组TNFα/β含量检测结果

注:对照组与突出型病例组比较，P<0.01；游离脱垂型病例组与对照组比较，P<0.01；突出型病例组与游离脱垂型病例组比较，P<0.01

2.2血浆sTNF-R1/R2标准曲线的建立及检测结果(见图3、图4)。

表2 对照组与实验组血浆sTNF-R1/R2定量检测结果

注：突出型病例组与对照组比较，P<0.01；游离脱乖型病例组与对照组比较，P<0.01；突出型病例组与游离脱垂型病例组比较，P<0.01

2.3 TNF-R1、TNF-R2的基因表达

2.3.1对照组和实验组椎间盘标本RNA电泳图(见图5)

28S是18S条带强度的两倍，认为RNA的质量是好的。

2.3.2内参照β-action和TNF-Rl/R2标准曲线的建立。

2.3.2.1内参照β-action PCR扩增产物在不同循环数表达电泳图及标准曲线(见图6、7)。

2.3.2.2TNF-R1PCR扩增产物在不同循环数表达的电泳图及标准曲线(见图8、9)。

2.3.2.3TNF-R2PCR扩增产物在不同循环数表达的电泳图(见图10)。

2.3.3对照组与实验组TNF-R1/R2在椎间盘中的表达与水平。

2.3.3.1对照组与实验组TNF-R1/R2 PCR扩增产物在骨髓标本中表达的电咏图(见图11)。

表3 对照组与实验组TNF-R1在骨髓中的表达水平的表达水平

注：突出型病例组与对照组比较，P<0.01，游离脱垂型病例组与对照组比较P<0.01；突出型病例组与游离脱垂型病例组比较，P<0.01。

图10 TNF-R2 PCR扩增产物在不同循环数

3 讨 论

目前研究认为，LDH发生在椎间盘退变的基础上，有机械负荷，炎症刺激、自身免疫等综合作用的结果。LDH是导致坐骨神经痛最常见原因。突出后引起的坐骨神经的放射痛是来源于神经根电生理的异常放电，例如机械性压迫、牵拉、和化学性因子刺激是导致这种异常放电的主要原因。在椎间盘突出、退变后可以合成和分泌许多种炎症介质[10]，它们共同加速了椎间盘退变的进展。局部椎间盘的炎性因子刺激其相邻的神经根造成脊神经根炎，从而引起其腰腿痛和神经功能的变化。在众多的细胞因子中肿瘤坏死因子大家族TNF-α含量的高低在某种程度上决定着疼痛的程度。

3.1TNF-α在IVDD和突出中的作用

本次试验证明，在椎间盘突出的标本组织中检测到TNF-α的含量较对照组明显增多，利用统计分析结果两者具有明显的差异性(P<0.01)。动物试验也证实了在没有外界压迫的因素下髓核组织能引起神经根和结构上的不同。国内外的学者也研究证实，在退变的椎间盘组织中存在较高的TNF-α，它可以促进椎间盘组织I型胶原明显合成的增加，并慢慢取代Ⅱ型胶原，进一步发展成椎间盘的纤维化[11]。

3.1.1TNF-a对神经根的直接影响

本试验研究中发现突出的椎间盘组织中含有大量的TNF-α，由TNF-α在退变椎间盘组织病理研究中，对其神经根影响的研究相对较多，它与众多炎性因子一起可引起神经根炎，这是由于纤维环破裂、髓核液漏至椎间盘外并沿着神经根扩散引起神经根炎症的一种状态。Ozaktay等在研究Sprague-Dawley大鼠中发现TNF-α、IL- 1可以造成神经末梢周围及背神经节的敏感性改变[12]，TNF-α的这一作用也支持了其作为下腰痛及坐骨神经痛中炎症反应介质这一观点。目前已有研究发现在突出的椎间盘组织中所产生的前列腺素E2(PGE2)，可以刺激神经根引起坐骨神经痛。Kayama等的研究发现，肿瘤坏死因子α和髓核组织都可诱导髓鞘损伤，轴突的变型以及神经传导功能的丧失[13]。Miyamoto等研究证实在突出的椎间盘组织中不仅含有大量的TNF-α，还含有IL-1和环氧化酶-2(COX-2)、COX-2调节前列腺素的合成，而TNF-α又加速COX-2的合成，最终会极大地增加前列腺素的生成，导致疼痛持续加剧，可以引起神经功能传导的障碍，还可以联合其它炎性介质对神经根造成继发性的病理改变。

3.1.2TNF-a的间接作用

本实验通过对退变椎间盘组织中TNF-α的含量以及症状评分的相关因素，证实了两者存在一定的相关性。对TNF-α而言，实验组椎间盘突出、脱出与对照组椎间盘完整者相比，差异具有显著性的意义(P< 0.01 )。TNF-α在退变椎间盘组织中的生成越多，其致病的作用就越明显，其临床表现也就越重，这可能是通过受体的上调或者下调来调节其局部炎症反应。所以肿瘤坏死因子对神经根的致痛作用和诱导细胞的凋亡作用与肿瘤坏死因子受体的数量以及sTNFR的含量相关联。

在临床上一部分患者通过影像学检查证实了有巨大的椎间盘突出，但从其临床体征和症状并不明显，即使有少部分患者神经根放射疼痛症状，服用一些非甾体类消炎止痛药大多能缓解，说明这类患者的椎间盘退变产生的细胞因子和炎性介质在起一定的作用，并没有对神经根造成压迫。所以有突出不一定产生疼痛，但有疼痛一定有炎症介质和细胞因子的参与。本次试验通过对患病组和对照组中髓核和纤维核中肿瘤坏死因子浓度的检测发现两者存在明显的差异。即实验组比对照组TNFα/β有较高的表达率(P<0.01)，说明肿瘤坏死因子及其受体与腰椎间盘的退变和患者的腰腿痛的严重程度呈正相关。术后患者的神经根压迫得以缓解，但仍然有神经根源性疼痛，服用非甾体类消炎药后症状有所减轻也说明了炎症介质参与了椎间盘退变的全过程。应用药后可能是减轻了局部神经根的刺激，或者减少了肿瘤坏死用因子的启动或数量，下调了及其受体的数量，不过这一结论还需要进一步的研究。这一推论为退变的椎间盘逆转和修复提供了可行的分析，为以后寻找抑制椎间盘细胞凋亡的人工合成因子提供了实验依据。

3.2肿瘤坏死因子受体在椎间盘退变和坐骨神经疼痛中的作用

研究表明TNFR1是肿瘤坏死因子的主要受体，TNFRl是介导细胞内信号的优势受体，在椎间盘退变的细胞中有较高的表达率。本次实验中患病组中的TNFR1明显高于对照组，实验组患者的坐骨神经疼痛的症状与其检测到的肿瘤坏死因子受体表达高低呈正相关，肿瘤坏死因子受体的上调或者下调决定了肿瘤坏死因子的表达高低，这种上调反作用于椎间盘的髓核、纤维核，以及软骨终板，使椎间盘进行的加速退变，纤维环破裂，髓核向后方突出，刺激或者压迫脊神经或脊髓引起患者坐骨神经的症状。

本实验通过建立肿瘤坏死因子及其受体的标准曲线，采用酶联免疫反应理方法，定量检测出了TNF-α/TNF-β以及sTNFRl/R2的含量。用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)法检测出靶细胞膜表面肿瘤坏死因子受体(TNFRl/R2mRNA)的表达。 通过组间t检验统计分析结果表明，实验组中TNF-α/TNF-β、TNFR、sTNFRS的含量明显高于对照组，提示着这些物质参与了椎间盘退变的进程。 TNF、TNFR、sTNFRS三者之间存在一定的相关性(P<0.05)，不是孤立存在的，三者之间在细胞因子和炎症介质的作用下相互作用，密切联系。

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