穿龙薯蓣纤溶酶分离及活性检测*

夏广清，宋金枝，刘 伟

(通化师范学院 生命科学学院，吉林 通化134002)

心脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病之一．近三十年来，我国人群心血管疾病的发病率及危险因素水平呈不断上升趋势．因此研发高效、特异、安全、副作用小的溶栓药物，一直是近年来医药界的热门课题[1]．活血化癖中草药具有“通利血脉，促进血行，消散癖血”等主要作用，其中有多种药物用于治疗血栓性疾病[2]．穿龙薯蓣(DioscoreanipponicaMakino)为薯蓣科薯蓣属多年生缠绕性草本植物,以根茎入药,干燥根茎为中药穿山龙,具有治疗冠心病、心绞痛[3]、风湿类风湿关节炎及保肝护肝[4]、抑制癌细胞增殖[5]等作用,近代药理研究表明,穿山龙还具有镇咳、祛痰、平喘、调节免疫和改善心血管功能等作用[6]．因此本研究以穿龙薯蓣为实验材料，采用硫酸铵沉淀、透析除去小分子物质、用纤维平板法初步判断穿龙薯蓣粗提物中溶纤成分，并对其活性做初步研究．为进一步开发具有溶栓功能的长白山道地药材提供理论依据．

1 实验材料和方法：

1.1 实验材料

中草药：穿龙薯蓣采自通化市园艺所，经生命科学学院秦佳梅教授鉴定为薯蓣科薯蓣属穿龙薯蓣．主要试剂：纤维蛋白原、纤维蛋白溶酶原、凝血酶购自中国药品生物制品检定所，标准尿激酶、牛血清白蛋白、胰蛋白酶、胃蛋白酶购自天津生物化学制药厂．

1.2 实验方法

(1)穿龙薯蓣蛋白质的提取．称取穿龙薯蓣干粉2g，浸于200ml PBS缓冲液中，4℃保存过夜，间隔时间震荡，离心(4℃,4000r/min)10min，取上清，80%饱和硫酸铵沉淀蛋白后，离心(4℃，8000r/min)10min，沉淀用PBS溶解，得到蛋白粗提液，装入透析袋用无离子水透析，每隔2h换一次溶液，取透析后的蛋白溶液冷冻干燥，-80℃冰箱中保存，备用．

(2)样品蛋白提取物浓度的测定采用考马斯亮蓝(G-250)法[7]测定蛋白质含量，取待测粗酶蛋白样品溶液0.1mL，加入5.0mL考马斯亮蓝溶液，测定595nm光吸收值，计算供试样品的蛋白浓度．

(3)蛋白提取物的体外纤溶活性鉴定．①纤维平板的配制(以配制5个平板为例):取0.125g琼脂糖加入25ml生理盐水中，加热溶解后置45℃水浴中保温30min后，加入500U凝血酶250ul，混匀．取80mg/支血纤维蛋白原1支于25ml巴比妥钠-盐酸溶液(pH 7.8)中，置45℃水浴中保温5min．分别取5ml凝血酶溶液和5ml血纤维蛋白原溶液混匀后快速倒入直径9cm平皿中，水平放置30min后，置4℃冰箱备用．②尿激酶标准曲线的制备:取浓度为100、200、300、400、500、600U/mL的尿激酶溶液10μL，加入平板中，封口膜封口，37℃培养箱培养18h，37℃保温，18h后测定尿激酶溶解圈直径.以尿激酶浓度为横坐标，活性溶解圈的直径为纵坐标制作标准曲线．③样品蛋白溶液酶活力测定:取10Ul穿龙薯蓣、蛋白质提取液加入纤维平板中，37℃培养箱培养18h，观察，如点样孔周围出现透明的溶圈，则证明被加样品有溶栓效果，测量溶圈直径，对照标准曲线可得到样品溶液相对尿激酶活力数．④蛋白提取物的溶纤比活力测定:蛋白比活力=相对尿激酶活力(U)/蛋白浓度(mg/ml)*点样体积．⑤纤溶酶的最适pH值和最适温度:最适pH值的测定：取蛋白质提取物10μL分别加到pH 2～8的缓冲液90μL中,在25℃温箱放置4h,测残余酶活.最适温度的测定：取用蛋白质提取物10μL与灭菌水90μL混合,分别在25,37,50,63和75℃放置4h,测残余酶活.

2 实验结果与分析

2.1 蛋白质含量的测定

表1 牛血清白蛋白标准曲线吸光值

图1 蛋白质标准曲线

根据标准蛋白的吸光值(表1)，绘制蛋白质浓度的标准曲线(图1)，由标准曲线得到蛋白质浓度的计算公式为：Y=0.0069x+0.0266，依据公式通过吸光值测得穿龙薯蓣粗酶蛋白含量为768.7μg/g．

2.2 蛋白质提取物溶纤活力及比活力的计算

表2 尿激酶标准曲线

图2 尿激酶活性测定

根据标准尿激酶溶圈的直径的平方(表2)绘制尿激酶标准曲线(图2)，由标准曲线得到酶活力的计算公式为Y=0.0101x+0.0597．根据公式由样品蛋白在纤维平板上的溶圈直径计算出穿龙薯蓣提取液蛋白质比活力为0.765.

2.3 穿龙薯蓣蛋白提取物体外溶栓实验

图3 纤维平板法测定穿龙薯蓣蛋白提取物的体外溶栓活性

由图3可见，穿龙薯蓣蛋白提取物具有体外溶解纤维蛋白的效果，溶圈透明部分明显，说明从穿龙薯蓣提取出的纤溶酶能够溶解血栓.

2.4 穿龙薯蓣蛋白提取物的最适pH值和最适温度

表3 穿龙薯蓣蛋白提取物的最适pH测定pH溶圈直径/cm1h2h4h2.75000.53.6800.450.554.00000.354.68000表4 穿龙薯蓣蛋白提取物的热稳定性温度/℃溶圈直径/cm2h3h4h25000.6537000.7540000.1750000

实验结果表明,穿龙薯蓣蛋白提取物对pH和温度条件要求较为严格，当pH超过3.68时，其活力开始下降，当达到4.68时，完全失活(表3)；在25～37℃温度范围内纤溶活性变化不明显，当温度达到40℃时，纤溶活性开始下降，到50℃时完全失活(表4).由此可以初步判断穿龙薯蓣蛋白提取物溶纤活性的最适温度为37℃，最适pH值为3.68．

3 讨论

血栓性疾病是严重威胁人类健康的疾病.纤溶系统对纤维蛋白的溶解、对血液的循环有重要的影响，纤溶酶活性的降低是导致血栓形成的主要原因之一.目前纤溶酶主要来源于动物和微生物，源于植物的纤溶酶很少．该试验从穿龙薯蓣分离得到纤溶酶并对其酶学性质进行初步研究.实验表明该酶最适pH值为3.68.在25～40℃温度范围内酶活性较稳定，50℃以上完全失活.有望将其开发成新型的溶栓类药物．

参考文献：

[1]何叶喧.中草药牛膝、茜草纤溶酶的筛选与分离纯化[D].保定:河北大学,2006.

[2]顾毅,时德,赵渝.肿瘤与静脉血栓形成的关系研究进展[J].中国癌症杂志,2011,12(1):85-88．

[3]杨波,李湘斌.HPLC测定地奧心血康胶囊中薯蓣皂苷元的含量[J].中国中医药杂志,2006,31(7):605-606.

[4]秦佳梅,牛志多,张卫东,等.长白山区栽培穿龙薯蓣采收期的研究[J].西北农林科技大学学报,2007,35(5):167-172.

[5]杨太新,陈凯,杜艳华,等.穿龙薯蓣的研究进展与发展前景[J].邯郸农业高等专科学校学报,2003,20(4):14-16.

[6]李景华,王化田,张成军.穿龙薯蓣种群生命表的研究[J].木本植物研究,2000,20(4):444-449.

[7]肖能庚,余瑞元,袁明秀,等.生物化学实验原理和方法[M].第二版.北京:北京大学出版社,2005.