发酵液中维生素B12检测方法的比较

李 莎，刘永飞，陈菲云，石 杨，张大伟＊，冉多良

（1，新疆农业大学 动物医学院，新疆 乌鲁木齐830052；2，中国科学院 天津工业生物技术研究所，天津300380）

维生素B12又叫钴胺素，高等动物和植物不能制造维生素B12，自然界中的维生素B12都是微生物合成。微生物合成的钴胺素包括羟基钴胺素、脱氧腺苷钴胺素、甲基钴胺素以及氰基钴胺素［1］。其中羟基钴胺素和氰基钴胺素为维生素B12的稳定存在形式，氰基钴胺素是在其它三种存在形式中人工加入氰基基团转化而成。所以准确检测微生物中羟基钴胺素的含量可以确定维生素B12的产量。

发酵作为生产维生素B12的有效方法，生产成本低、生产效率高被广泛应用。但是培养过程中需要加入前体物5、6-二甲基苯并咪唑（DMB）、成分复杂的玉米浆作为氮源、以及嵌合的钴原子等培养基［2］。培养基成分复杂，同时发酵过程中产生的其他发酵产物对维生素B12的检测具有很大的干扰作用。目前采用的方法主要有 TLC［3］、HPLC［4］。维生素B12检测方法的优化对高产菌株筛选以及生产菌株的筛选具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 试 剂 羟基钴胺素（hydroxycobalamin），购自sigma公司。硅胶G预制板，购自青岛海洋化工厂。乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），KHPO（分析纯），HPO（分析纯）

1.1.2 仪 器 Agilent1260高效液相色谱分析仪（VWD检测器），Bruke质谱分析仪，色谱柱C18（5 μm，4.6 mm＊25 cm）购自大连中谱科技有限公司，紫外照射仪，sigma低温离心机。

1.1.3 菌 种 费氏丙酸杆菌（Propionibacterium freudenreichii）CICC：10019，购自中国工业微生物菌种保藏中心。

1.1.4 培养基 种子培养基为玉米浆50 g，葡萄糖20 g，0.1%CoCl24.0 m L，（NH4）2SO42.0 g，K2HPO48.0 g，蒸馏水1.0 L.p H 6.8～7.0。发酵培养基为玉米浆50 g，葡萄糖20 g，0.1%CoCl212.0 m L，DMB 0.01g，（NH4）2SO42.0g，K2HPO48.0 g，蒸馏水1.0 L.p H 6.8～7.0。

1.2 方 法

1.2.1 标准品制备 精确称取2 mg标准品溶解于1 m L超纯水中制备成母液，逐渐稀释为0.1 g／L，0.2 g／L，0.5 g／L，0.7 g／L，0.9 g／L标准品。

1.2.2 菌体培养和样品处理［5］划线培养挑取单菌落于种子培养基中生长培养至OD＝3.0左右，5%接种于发酵培养基中培养72 h，4 000 r／min离心收集菌体，研磨破碎菌体后沸水浴中煮沸30 min，12 000 r／min离心收集上清，45μm水系滤膜过滤。根据文献［6］中报道高产菌株的产量，样品中加入终浓度为0.25 g／L标准品相当于高产菌株。对照三种方法检测结果。

1.2.3 薄层层析（TLC）方法 硅胶G板，展开剂：甲醇-水（6∶1），样品经展开剂展开后将层析板在紫外照射仪中观察结果，确定羟基钴胺素最低浓度。

1.2.4 液相色谱条件 流动相Ⅰ：KH2PO4（50 m M，p H＝3.0），流动相Ⅱ乙腈。洗脱条件为0～5 min，10%乙腈恒速洗脱；5～15 min，10%～20%乙腈梯度洗脱；15～20 min，20%乙腈恒速洗脱。吸收波长361 nm，柱温25℃，流速1.0 m L／min，进样量10μL。

1.2.5 质谱条件 质谱离子源为电喷雾源（ESI），正离子模式；碰撞室气体为氮气；雾化器压力：50 psi；干燥器流速：11 L／min，干燥器温度：350℃；毛细管电压：4.0 k V［7］。采用多离子反应监测器。

2 结果与分析

2.1 薄层层析法

维生素B12可结合钴原子，显示为红色，在日光灯下可观察出Rf的大小。维生素B12结构中具有共轭双键，可以吸收254 nm紫外线。点样，展开剂展开后观察标准品最低浓度均为0.5 g／L。以0.5 g／L标准品为对照定性鉴别样品中维生素B12。发酵液中加入标准品后标准品的Rf和标准品的Rf不同，说明了发酵液会影响维生素B12的检测，见图1。

2.2 高效液相色谱法

图1 薄层层析结果1.细菌破碎液；2.细菌破碎液加入0.5 g／L羟基钴胺素标准品；3.0.5 g／L羟基钴胺素标准品Fig.1 The results of TLC1.bacteria broken liquid；2.bacteria broken solution containing 0.5 g／L hydroxycobalamin standard；3.0.5 g／L hydroxycobalamin standard

0.1 g／L，0.2 g／L，0.5 g／L，0.7 g／L，0.9 g／L羟基钴胺素标准品，上样量为10μL，分别测得峰面积积分值。以峰面积积分值的对数为纵坐标，进样量的对数为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程：logy＝1.0012log X＋4.0371（r＝0.9997）在100～900μg范围内，样品进样量的对数值与峰面积积分值的对数值呈良好的线性关系。

发酵液中加入标准品后，保留时间从14.679 min变为20.612 min；样品中相似的成分很多，导致出峰较宽无法判断是否存在维生素B12，如图2所示。

图2 液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram

2.3 质谱法

试验采用ESI源作为离子源，正离子扫描模式，以MRM方式进行定量，通过全扫描可得到维生素B12的母离子（m／z）为678.3，是其分子式（C63H88CoN14O14P）计算值加2H的一半，说明此化合物在ESI正离子模式下，生成［M＋2H］＋准分子离子峰。通过子离子扫描发现子离子m／z 147具有较高的相对丰度，当碰撞能量为40 V、裂解电压为150 V时达到最大值，此值大于子离子m／z 359的最大丰度值（碰撞能量为21 V、裂解电压为150 V）。因此选择m／z 147作为定量离子，选择m／z 359作为辅助定性离子。通过质谱方法检测，标准品和样品中加入标准品时能够检测到子离子147和359，但是单纯样品中不能检测到这两种子离子，说明质谱检测方法与样品结果相一致，准确率高。三种样品的质谱图见图3。

图3 质谱图Fig.3 Mass spectra

3 讨 论

发酵液中成分复杂，为优化检测发酵液中稳定存在的羟基钴胺素方法，在发酵液中加入标准品可以视作高产菌株。TLC、HPLC可检测成分简单的产品中维生素B12，并且重复率高。但是发酵液中培养基和产物的成分复杂，并且维生素B12的产量相对过低，结果就会影响维生素B12的检测。

通过三种检测方法结果的对照，TLC检测结果中高产菌株与标准品中维生素B12的Rf不相同，因此TLC检测方法中发酵液影响了维生素B12的检测。HPLC中低产菌株、高产菌株、标准品出峰时间分别为20min左右、20.612min、14.679min，HPLC重复率低偏差大。LC-MS在定性鉴别维生素B12时，高产菌株和标准品中都可以检测出小分子147和359，但是样品中却没有检测出这两种小分子物质，说明LC-MS能够精确检测出发酵液中存在的微量维生素B12。LC-MS在筛选维生素B12生产菌株和高产菌株中具有重要意义。

［1］ 王 磊，张玉明，王云山，等.维生素B12的光解研究及发酵液中维生素B12检测新方法的建立［J］.中国生物工程杂志，2006，26（4）：81-85.

［2］ 马 蕙，王丽丽，张春晓，等.维生素B12的生物合成发酵生产与应用［J］.生物工程学报，2008，24（6）：927-932.

［3］ 于健东，马玲云，马双成，等.知母中知母皂苷BⅡ的TLC鉴别及 HPLC法含量测定［J］.药物分析杂志，2005，25（12）：1 436-1 437.

［4］ Arkadiusz Szterk，Marek Roszko，Krystian Malek，et al.Application of the SPE reversed phase HPLC／MS technique to determine vitamin B12bio-active forms in beef［J］.Meat Science，2012，91：408-413.

［5］ Alicja Kosmider，Wojciech Bialas，Piotr Kubiak，et al.Vitamin B12productio from crudeglycerol by Propionibacterium freudenreichii sp.shermanii：Optimization of medium composition through statistical experimental designs［J］.Bioresource Technology，2012，105：128-133.

［6］ 程 瑶.维生素B12发酵工艺进展［J］.河北化工，2012，35（10）：23-26.

［7］ 徐双阳，虚荣年，汪庆旗，等.超高效液相色谱-质谱联用测定婴幼儿配方奶粉中的维生素B12［J］.食品工业，2011（8）：103-105.