佛波酯诱导血小板黏附受体GPⅠbα酶切的机制研究

王志成，罗梅宏，谢如锋，张晓峰

(1.上海中医药大学附属市中医医院实验中心，上海200071;2.上海市血液中心血液工程室，上海200051)

血小板在活化的同时，伴随有黏附受体GPⅠbα的酶切，产生的酶切片段称为糖盏蛋白(glycocalicin，GC)［1］。GPⅠbα 酶切是血小板储存损伤(platelet storage lesion，PSL)一个重要的生物标志物［2］。因此，阐明GPⅠbα酶切的机制将有助于认识血小板储存损伤的机理。

佛波酯 (phorbol12-myristate-13-acetate，PMA)是常用的蛋白激酶 C(protein kinase C，PKC)的活化剂。PMA 能诱导 GPⅠbα 酶切［3］，但是PMA诱导GPⅠbα酶切的分子机制尚未完全阐明。我们主要探讨了PMA诱导GPⅠbα酶切的分子机制。

材料和方法

一、材料

1.研究对象 选取健康志愿者10名，男、女各5名，经上海中医药大学附属市中医医院伦理审查委员会批准同意，志愿者均签署知情同意书。

2.主要试剂 抗GPⅠbα N端单克隆抗体SZ-2、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG二抗购自Santa Cruz公司;GM6001购自Calbiochem公司;二硫苏糖醇(DTT)、NAD(P)H氧化酶抑制剂(DPI)、蛋白激酶 C(PKC)抑制剂(BIM)、佛波酯(PMA)、ROS检测探针DCFDA购自Sigma公司;PKC活性检测试剂盒购自Promega公司;线粒体活化氧(ROS)拮抗剂MitoQ购自苏州沃盛化学有限公司。

二、方法

1.制备洗涤血小板 取健康自愿者静脉血，用柠檬酸盐缓冲液(ACD)按照1∶7抗凝，380×g离心20 min得到富含血小板血浆(PRP)，PRP经1 500×g离心20 min，沉淀用葡萄糖柠檬酸盐缓冲液(CGS)缓冲液悬浮，经离心、洗涤，最后用MTB液重悬，得到洗涤血小板，调整血小板浓度为3×108/mL，室温静置1 h使其恢复至静息状态以备用［4］。

2.Western blot检测 GPⅠbα酶切片段 3×108个/mL洗涤血小板与1.0 μmol/L PMA或二甲基亚矾(DMSO)37℃孵育30 min，2 600×g离心5 min，得到上清，加入5×上样缓冲液和β-巯基乙醇，最后样品经western blot检测GPⅠbα酶切片段。抑制实验:3×108个/mL洗涤血小板预先与100 μmol/L BIM、DTT(25、50、100、200 μmol/L)或DMSO 37℃孵育15 min后，再与1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

3.流式细胞仪检测ROS 3×108个/mL洗涤血小板分别与不同浓度PMA(0.25、0.5、1.0、2.0 μmol/L)或 DMSO 37 ℃孵育 30 min，加 ROS检测探针 DCFDA(20 μmol/L)孵育10 min，经稀释后，用流式细胞仪进行检测。抑制实验:3×108个/mL洗涤血小板预先与 10 μmol/L DPI、100 μmol/L MitoQ、100 μmol/L BIM、200 μmol/L DTT或DMSO 37℃孵育15 min，再与1.0 μmol/L PMA 37℃孵育30 min。

4.检测PKC活性 3×108个/mL洗涤血小板与1.0 μmol/L PMA或DMSO 37℃孵育30 min。抑制实验:3×108个/mL洗涤血小板预先与200 μmol/L DTT、100 μmol/L BIM 或 DMSO 37 ℃孵育 15 min，再与 1.0 μmol/L PMA 37 ℃ 孵育30 min。使用非同位素标记的PKC活性检测试剂盒，先抽提PKC，再检测。具体步骤按说明书操作。

三、统计学方法

结 果

一、BIM抑制 PMA诱导的 GPⅠbα酶切的分析

PMA是常用的PKC活化剂，能诱导GPⅠbα酶切。为了证实PKC在PMA诱导GPⅠbα酶切中的作用，本研究使用PKC特异性抑制剂BIM，同时使用解离素-金属蛋白酶17(a disintegrin and metalloproteinase 17，ADAM17)抑制剂GM6001作为对照。图1结果显示，BIM完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切;GM6001能完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切。

图1 BIM完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切

二、DTT抑制 PMA诱导的GPⅠbα酶切的分析

ROS通过氧化ADAM17的半胱氨酸残基调控ADAM17活性［5］。为了证实 ROS是否参与PMA诱导的GPⅠbα酶切，本研究使用ROS抑制剂DTT。结果显示DTT浓度依赖地抑制PMA诱导的GPⅠbα 酶切，在高浓度(200 μmol/L)时能完全抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切。表明ROS参与调控PMA诱导的GPⅠbα酶切。见图2。

图2 DTT浓度依赖地抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切

三、PMA浓度依赖地诱导血小板产生ROS

为了证实PMA是否诱导血小板产生ROS，本研究使用ROS检测探针DCFDA。图3结果显示，PMA浓度依赖地诱导血小板产生ROS，表明PMA能够诱导血小板产生ROS。

图3 PMA浓度依赖地诱导血小板产生ROS

四、NAD(P)H氧化酶抑制剂抑制PMA诱导的ROS

ROS主要由线粒体呼吸链和NAD(P)H氧化酶产生［6］。为了证实PMA诱导产生的ROS的来源，本研究使用线粒体靶向的ROS拮抗剂MitoQ和DPI。图4结果显示，MitoQ不抑制PMA诱导产生ROS，而DPI则抑制PMA诱导产生ROS，表明PMA诱导产生的ROS来自NAD(P)H氧化酶。

图4 DPI抑制PMA诱导的ROS

五、PKC抑制剂抑制PMA诱导的ROS

为了证实PMA诱导产生ROS是通过活化PKC，本研究使用BIM。图5结果显示，BIM抑制PMA诱导的 ROS，表明PKC参与 PMA诱导的ROS，提示PKC可能在ROS信号通路的上游。

六、ROS抑制剂不抑制PMA诱导的PKC活化

为了进一步证实PKC与ROS之间的上下游关系，本研究使用PKC活性检测试剂盒。图6结果显示，DTT不影响PMA诱导的 PKC活性，而BIM则抑制PMA诱导的PKC活化。

图5 BIM抑制PMA诱导的ROS

图6 DTT不抑制PMA诱导的PKC活化

讨 论

GPⅠbα是血小板膜受体GPIb-IX-V复合物中最重要的一个亚基，能与血管性血友病因子(VWF)、凝血酶、P-选择素等结合，在血小板血栓形成的起始阶段起关键作用［7］。血小板在活化的同时，伴随有GPⅠbα酶切，产生的酶切片段称为 GC［1］。

最近Bergmeier等［8］使用基因敲除小鼠证实ADAM17是负责酶切 GPⅠbα的主要蛋白酶。ADAM17由824个氨基酸残基组成的I型跨膜蛋白，含有多个结构域。从N端开始包括:信号肽、前域、金属蛋白酶域、解离素域、表皮生长因子样域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞质尾［9］。已有报道，ADAM17的前域、半胱氨酸富含域、跨膜域和胞质尾参与ADAM17的活性调节［10］。其中，胞质尾在ADAM17活性调控中的调节存在争议，有些报道认为ADAM17胞质尾的丝氨酸被p38促分裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)或PKC磷酸化引起ADAM17活性增加［11-12］;另一些报道认为胞质尾不参与调控ADAM17活性［13］。PMA是PKC活化剂，常用于ADAM17底物酶切的研究。Killock等［12］报道，PMA先活化PKC，活化的PKC直接磷酸化ADAM17胞质尾的丝氨酸，进而活化ADAM17引起底物的酶切。PMA能够诱导GPⅠbα酶切已被很多文献报道［3］。然而，PMA 诱导 GPⅠbα酶切的信号通路目前还未完全阐明。本研究使用各种抑制剂，结果表明在PMA诱导的GPⅠbα酶切中，可能存在“PMA-PKC-NAD(P)H氧化酶-ROS-ADAM17-GPⅠbα酶切”信号通路。本研究进一步支持ADAM17的胞质尾可能不参与调节ADAM17活性。NAD(P)H氧化酶是由5个主要亚基构成的酶复合体［14］。PKC如何引起NAD(P)H氧化酶活化本研究未涉及，可能通过直接或间接的方式，目前这方面的研究正在进行中。

近年来，ROS在调控ADAM17活性方面逐渐引起人们的关注［5］。ROS的来源主要有线粒体呼吸链和NAD(P)H氧化酶。本研究结果显示，PMA通过活化PKC，PKC通过直接或间接途径活化NAD(P)H氧化酶，产生ROS，ROS通过直接或间接的方式活化ADAM17，进而引起GPⅠbα酶切。有报道，ROS能直接通过氧化ADAM17的半胱氨酸残基直接活化ADAM17［5］;也有报道，ROS通过活化p38MAPK进而引起ADAM17的活化［15］。ROS如何引起ADAM17活化本研究未涉及，可能通过直接或间接的方式，目前这方面的研究正在进行中。

最近的研究报道，钙离子依赖蛋白酶(calpain)参与 A23187、凝血酶(在搅拌条件下)和calpain活化剂dibucaine诱导的GPⅠbα 酶切［16］。本研究使用calpain抑制剂MDL28170，结果发现MDL28170不抑制PMA诱导的GPⅠbα酶切，表明不同的诱导剂引起的GPⅠbα酶切涉及不同的信号通路。

综上所述，本研究证实PMA诱导GPⅠbα酶切不是通过PKC直接活化 ADAM17，而是通过NAD(P)H氧化酶产生的ROS活化ADAM17。本研究结果有助于进一步认识GPⅠbα酶切的机制。阐明GPⅠbα酶切的机制不仅有助于认识血小板血栓形成的机理，而且为认识血小板储存损伤提供新的视角。

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