五种耐甲氧西林金黄色葡萄球菌检测方法的比较

陈碧英，马晨芸，李志兰，陈佩宏，陆志成，郎立中

(上海市第七人民医院检验科，上海200137)

近年来，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)在世界各地感染率和分离率不断升高，已成为目前医院内感染的主要病原菌之一。由于MRSA对所有的β-内酰胺类抗菌药物耐药，所致感染呈散发或爆发流行，治疗困难，病死率高，成为临床治疗的一大难题［1］。因此，快速和准确地检测MRSA，对于控制医院内感染的流行，指导临床治疗有着非常重要的意义。本研究将MRSA ID产色培养基法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林最低抑菌浓度(MIC)法、青霉素结合蛋白(PBP2a)乳胶凝集法与荧光聚合酶链反应(PCR)检测mecA基因进行比较，旨在找出准确、快速、简便的适用于临床微生物实验室检测MRSA的方法。

材料和方法

一、材料

1.菌株 收集2010年1月至2012年2月上海市第七人民医院临床分离的金黄色葡萄球菌158株、表皮葡萄球菌12株、溶血葡萄球菌10株、人葡萄球菌1株，共181株葡萄球菌。标本来自痰液、咽拭子、脓液、血液，去除同一患者重复标本。所有菌株经WalkAway-40微生物鉴定药物敏感性分析仪鉴定。质控菌株为金黄色葡萄球菌(ATCC 29213、ATCC 25923)，由上海市临床检验中心提供。

2.试剂 MRSA ID产色培养基、PBP2a乳胶凝集检测试剂盒为法国生物梅里埃公司产品，头孢西丁(30 μg/片)纸片为Oxoid公司产品，水解酪蛋白胨琼脂(MH)平板购自上海科玛嘉公司，PC20细菌鉴定药物敏感性复合板购自德国西门子公司产品，MRSA耐药基因检测试剂盒购自上海之江生物科技有限公司产品。

3.仪器 WalkAway-40微生物鉴定药物敏感性分析仪为德国西门子公司产品，LightCycler 480Ⅱ荧光定量PCR仪为罗氏公司产品。

二、方法

1.荧光PCR 参照MRSA耐药基因检测试剂盒说明书操作和判断结果。操作步骤主要包括:(1)核酸裂解处理;(2)反应溶液配制;(3)PCR扩增反应。

2.MRSA ID产色培养基法 挑取已鉴定过的181株葡萄球菌单个菌落接种到产色培养基上，分区划线，于(35±1)℃有氧条件下进行孵育，24 h观察结果，出现绿色菌落为阳性，判定为MRSA。

3.头孢西丁纸片扩散法 将金黄色葡萄球菌用生理盐水比浊为0.5麦氏单位的悬液，涂布到MH平板上，贴上头孢西丁药物敏感性纸片，35℃孵育16～18 h量取抑菌圈直径，根据美国临床实验室标准化协会(CLSI)M100-S20标准，头孢西丁抑菌圈直径≤21 mm为耐药，≥22 mm为敏感［2］。

4.苯唑西林MIC法 用PC20细菌鉴定药物敏感性复合板进行细菌鉴定和药物敏感性试验，根据CLSI金黄色葡萄球菌苯唑西林MIC＞2 μg/mL判断为MRSA。

5.PBP2a乳胶凝集法 参照MRSA乳胶凝集试剂盒说明书操作和判断结果，操作步骤主要包括PBP2a提取和乳胶凝集。

三、统计学方法

用SPSS 19.0软件进行分析。以荧光PCR为标准，比较MRSA ID产色培养基法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林MIC法、PBP2a乳胶凝集法的敏感性、特异性。各种方法与PCR的一致性用Kappa检验，Kappa值≥0.75为具有较好的一致性。

结 果

一、荧光PCR检测mecA基因

在181株葡萄球菌中，金黄色葡萄球菌阳性158株，mecA基因阳性130株，MRSA 119株，甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)39株，mecA基因阳性其他葡萄球菌11株，mecA基因阴性其他葡萄球菌12株。PCR反应曲线见图1。

图1 荧光PCR曲线图

二、MRSA ID产色培养基法、头孢西丁纸片扩散法、苯唑西林MIC法、PBP2a乳胶凝集法检测MRSA

MRSA ID产色培养基上孵育24 h后，可见119株较大绿色菌落，5株较小绿色菌落，1株较小白色菌落，其余均不生长，判断为124株阳性;头孢西丁纸片扩散法检出MRSA 119株;苯唑西林MIC法检出MRSA 117株;PBP2a乳胶凝集法检出MRSA 117株。与PCR比较，各种方法敏感性和特异性见表1。

表1 5种检测MRSA方法的比较

讨 论

金黄色葡萄球菌对甲氧西林耐药，其机制主要是由于携带mecA基因，也可能因为产生高水平的β-内酰胺酶和获得性PBP2a以外的其他PBP修饰［3］。目前用于检测MRSA的方法有多种，检测mecA基因或mecA表达的PBP2a是预报苯唑西林耐药最准确的方法［2］。但这2项技术试验条件要求高且价格昂贵，不适合临床实验室作为常规方法［4］。

本研究用5种方法检测了181株葡萄球菌，其中mecA阳性MRSA 119株，4种方法与PCR检测法比较均有较好的一致性。本研究显示，头孢西丁纸片扩散法的敏感性和特异性最高，均为100.0%，与PCR检测mecA基因的Kappa值为1.000，说明完全一致，可见头孢西丁可作为检测mecA介导的苯唑西林耐药的替代品，与Gupta等［5］的研究结果一致。头孢西丁纸片扩散法简便易行，也是CLSI推荐的临床常规检测MRSA的方法，但从临床标本中检测MRSA需48 h。MRSA ID产色培养基法敏感性为100.0%，高于苯唑西林MIC法(97.5%)和PBP2a乳胶凝集法(98.3%)，特异性为91.9%，低于其他方法。鉴定假阳性的5株菌株为PCR mecA基因阳性其他葡萄球菌，可见凝固酶阴性高耐药的葡萄球菌对显色可能有一定的干扰，而39株MSSA完全没有干扰。近年来，国内、外各种产色培养基被应用于鉴定MRSA［6-7］，也被直接应用于血培养瓶、伤口脓液、脓肿的标本检测，18～24 h就能检测出MRSA［8-9］，缩短了检测时间，并显示出了高敏感性和特异性。本研究有1株金黄色葡萄球菌苯唑西林耐药而mecA基因阴性，分析原因可能与菌株产生高水平的β-内酰胺酶或存在PBP2a以外的低亲和力PBP有关，还需进一步证实。在mecA基因阳性的菌株中，表现为苯唑西林敏感的3株金黄色葡萄球菌，可能是因为位于mecA启动子上游的转录调节基因mecⅠ的作用特别强大而诱导剂的作用较弱时，mecA基因处于抑制状态，表达PBP2a的量很少［10］，或是辅助基因fem的失活致高耐菌株变为低耐菌株［11］，这3株金黄色葡萄球菌头孢西丁纸片扩散法结果与mecA基因检测一致，进一步证实了头孢西丁纸片扩散法的优越性。有研究结果显示，头孢西丁纸片扩散法可用于检测各种表型的MRSA，尤其对低水平、异质性耐药的MRSA，其敏感性高于其他筛选试验［12］。

MRSA往往表现为多重耐药，早期检测不仅是感染控制的关键，也是临床上决定是否使用糖肽类和恶唑烷酮类抗菌药物的关键。综上所述，头孢西丁纸片扩散法是临床实验室检测MRSA的常规方法，为了避免mecA基因阴性的MRSA漏检，建议同时做苯唑西林纸片扩散法。而应用产色培养基法进行MRSA快速检测，将为MRSA院内感染爆发的监测、感染的预防控制以及临床上抗菌药物的使用提供快速、可靠的依据。

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