哈萨克族食管癌患者中Lrig1通过MEK-ERK信号通路调控NF-κB及MMP-2表达*

姜孝芳 李 卉 刘 玲 王洪江 李秀梅 陈 艳 庞作良谌宏鸣 尹 娜 李 艳 沙亚哈提·别尔克哈之 李惠武

食管癌发病具有民族及地区差异性，新疆哈萨克族食管癌的发病率远高于同地区其他民族［1-2］。研究哈萨克族食管癌患者基因表达，对食管癌发病机制的阐明具有重要意义。富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白1（Lrig1）是负调控表皮生长因子（EGFR）的上游因子［3］，在大多数肿瘤组织中Lrig1表达缺失或减弱［4］，被认为是评价预后的指标［5］。本研究检测48例哈萨克族食管癌患者组织中Lrig1与核转录因子-κB（NF-κB）及基质金属蛋白酶-2（MMP-2）基因的表达，探讨Lrig1在哈萨克族食管癌患者中的表达意义及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

标本来源于2008年1月至2009年6月新疆医科大学附属肿瘤医院胸外科48例新疆哈萨克族食管鳞癌手术患者（包括癌组织及相距6 cm以上的远端正常组织），本研究已获新疆医科大学附属肿瘤医院伦理委员会批准，患者均签知情同意书。其中男性33例，女性15例，年龄37～67岁，术前均未行放疗和化疗。Ⅰ期1例，Ⅱa期13例，Ⅱb期5例以及Ⅲ期29例；其中高、中分化41例，低分化7例；淋巴结转移31例，无淋巴结转移17例。

1.2 方法

组织中总RNA提取，采用Trizol（Invitrogen公司，美国）法提取总RNA，然后进行下一步RT-PCR。PCR扩增产物以2%琼脂糖凝胶电泳，以GAPDH为内参基因，引物序列及退火温度见表1。

采用Western blot进行蛋白检测，取100～150 mg组织加入10倍体积裂解液，裂解液为1 mM EDTA，1 mM EGTA，150 mM NaCl，5 mM Tris·HCl，1%NP-40，0.1%SDS，1 mM PMSF。上样总蛋白为60 mg，10%SDS PAGE电泳，转膜，封闭。一抗孵育：Lrig1、GAPDH购自美国Santa Cruze公司，MMP-2购自北京中杉金桥公司，NF-κB购自美国Cell Signaling公司；二抗孵育；ECM显色。

1.3 统计学方法

所有数据均采用所有数据均采用SPSS 17.0软件进行统计分析。χ2及Phi检验进行关联分析，以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 Lrig1、NF-κB及MMP-2 mRNA在癌组织及远端正常组织的表达

Lrig1、NF-κB及MMP-2组织中的协同表达率为52.1%（25/48），高于正常组织29.2%（14/48），差异有统计学意义（P=0.019，表2），Lrig1、NF-κB及MMP-2基因PCR电泳见图1。

在Lrig1、NF-κB及MMP-2 mRNA协同表达的组织中检测Lrig1、NF-κB及MMP-2蛋白的表达，结果显示NF-κB与Lrig1蛋白表达具有相关性。Lrig1高表达的组织中，NF-κB表达弱（6N，7T），而在Lrig1弱表达或基本不表达的组织中NF-κB表达高（6T，7N）（图2A）。在Lrig1高表达的组织中，MMP-2表达弱（9T，9N），而在Lrig1表达弱或基本不表达的组织中MMP-2表达高（10T，10N，11T）（图2B）。提示Lrig1与NF-κB及MMP-2之间可能呈负相关，需要扩大样本进一步验证。

表1 各基因引物Table1 Specific primer for genes

表2 哈萨克族食管癌患者Lrig1与MMP-2和NF-κB表达Table2 mRNA co-expression of Lrig1，NF-κB，and MMP2 in Hazak's ESCC

图1 各基因2%琼脂糖凝胶电泳图Figure1 2%agarose gel electrophoresis pattern of the genes

2.2 Lrig1与PI3K信号通路及MEK-ERK信号通路的关系

检测PI3K、AKT1、MEK1、MEK2、MEK5、ERK1 、ERK2基因mRNA在标本中的阳性率，分析以上各基因表达与Lrig1 mRNA的关系。结果显示癌组织中MEK5、ERK2与Lrig1相关（P＜0.05），在远端正常组织中 PI3K 表达与 Lrig1相关（P＜0.001），其他基因MEK1、MEK2、ERK1、AKT1在癌组织及远端正常组织中与Lrig1不相关（P＞0.05），R为Phi相关系数（表3）。

图2 Lrig1、NF-κB、MMP-2 10%PAGE电泳图Figure2 PAGE gel electrophoresis patterns of Lrig1,NF-κB,and MMP-2

2.3 Lrig1、MMP-2及NF-κB mRNA的协同表达标本与临床病理指标的关系

Lrig1、MMP-2及NF-κB mRNA协同表达的标本中80%（20/25）发生了淋巴结转移，而在非协同表达的标本中只有47.8%（11/23）发生了淋巴结转移，差异具有统计学意义（P=0.020，表4），提示Lrig1、MMP2及NF-κB mRNA的协同表达促进淋巴结转移。

表3 哈萨克族食管癌患者组织中NF-κB、MMP-2、MEK1、MEK2、MEK5、ERK1、ERK2、PI3K、AKT1与Lrig1的相关性（n=48）Table3 Relationship of Lrig1 expression with NF-κB,MMP-2,MEK1,MEK2,MEK5,ERK1,ERK2,PI3K,and AKT1 in cancer tissues of Hazak's ESCC(n=48)

表4 Lrig1、NF-κB、MMP2 mRNA协同表达与临床病理指标的关系Table4 Relationship of the co-expression of Lrig1,NF-κB,and MMP2 mRNA with clinicopathological indices

3 讨论

大多数肿瘤中Lrig1表达缺失或减弱，而在有些肿瘤中表达上调［6-7］。Lrig1在肿瘤中表达的不一致性体现了Lrig1抑癌基因和癌基因的双重性，研究发现Lrig1的双重性可能与其蛋白的亚细胞定位有关，定位于细胞核周，其功能为抑癌基因作用，而定位于胞浆则为癌基因作用［8］。瑞典的学者研究发现，Lrig1蛋白在食管癌核周及胞浆均有表达，但主要定位于胞浆［9］。本研究在48例食管癌标本中检测Lrig1 mRNA的表达，发现Lrig1在多数肿瘤组织中有弱表达，表现为抑癌基因作用；但其在个别肿瘤组织中高表达，且Lrig1在肿瘤组织中的阳性表达率高于远端正常组织，表现为癌基因作用。据此推测Lrig1在哈萨克族食管癌患者中，可能起到癌基因与抑癌基因双重作用，该作用是否与其蛋白的亚细胞定位有关，有待进一步的研究。

MMP-2通过与细胞粘附分子相互作用降解细胞外基质成分，肿瘤细胞可以在MMP-2的作用下将基底膜成分降解形成孔隙样结构，并在其他基因产物的协同作用下完成侵袭过程，调控肿瘤新生血管形成，与肿瘤浸润相关［10-11］。核转录NF-κB是广泛存在于哺乳动物细胞中的转录因子，除主要参与炎症和自身免疫反应相关的基因调控，近些年来发现NF-κB对肿瘤的起源、发展、血管新生和转移及肿瘤细胞凋亡具有重要作用［12-13］。

本研究发现NF-κB、MMP-2的表达与Lrig1有关，在Lrig1弱表达的标本检测到NF-κB及MMP-2基因的高表达，提示在哈萨克族食管癌患者中Lrig1与NF-κB、MMP-2可能存在一种负调控的关系，而采用Western blot进行蛋白检测的结果也验证了这种推测。Lrig1与NF-κB及MMP-2的调控又是通过何种途径尚不清晰，NF-κB是MEK-ERK信号通路的下游因子［14］，可调控MMP-2的表达从而影响肿瘤的浸润［15-16］。Lrig1 是否通过调控NF-κ B进而调节MMP-2表达，影响肿瘤的浸润，需要进一步深入的研究。本研究通过检测MEK-ERK信号转导通路及PI3K-AKT信号转导通路上的关键因子，发现MEK5、ERK2与Lrig1表达相关，而MEK1及MEK2无论在Lrig1阳性及阴性表达的标本中均高表达，虽然统计学分析显示与Lrig1的表达不存在关联，但哈萨克族食管癌患者中MEK1及MEK2是一种高表达状态。这提示Lrig1与NF-κB及MMP-2的协同表达可能与MEK-ERK信号转导通路密切相关。

综上所述，本研究提示在新疆哈萨克族食管癌患者中Lrig1可能主要是通过MEK-ERK信号通路调控NF-κB及MMP-2的表达，从而影响肿瘤的淋巴结转移。

1 Guo B,Huang ZL.Esophageal cancer mortality trends in rural and urban China between 1987 and 2009[J].Asian Pac J Cancer Prev,2011,12(8):2105-2110.

2 赵凤娟,云妙英,张 严,等.新疆哈萨克族食管癌研究进展[J].中央民族大学学报(自然科学版),2009,18(3):85-90.

3 Segatto O,Anastasil S,Alemà S.Regulation of epidermal growth factor receptor signalling by inducible feedback inhibitors[J].J Cell Sci,2011,124(Pt11):1785-1793.

4 邢细红,王雄伟.LRIG1基因与肿瘤关系的研究进展[J].重庆医学,2010,40(11):1120-1122.

5 Lindström AK,Asplund A,Hellberg D.Correlation between LRIG1 and LRIG2 expressions and expression of 11 tumor markers,with special reference to tumor suppressors,in CIN and normal cervical epithelium[J].Gynecol Oncol,2011,122(2):372-376.

6 Bhattacharjee A,Richards WG,Staunton J,et al.Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2001,98(24):13790-13795.

7 Krig SR,Frietze S,Simion C,et al.Lrig1 is an estrogen-regulated growth suppressor and correlates with longer relapse-free survival in ERa-positive breast cancer[J].Mol Cancer Res,2011,9(10):1406-1417.

8 Yi W,Haapasalo H,Holmlund C,et al.Expression of leucine-rich repeats and immunoglobulin-like domains(LRIG)proteins in human ependymoma relates to tumor location,Who grade,and patient age[J].Clin Neuropathol,2009,28(1):21-27.

9 Wu X,Hedman H,Bergqvist M,et al.Expression of EGFR and LRIG proteins in oesophageal carcinoma with emphasis on patient survival and cellular chemosensitivity[J].Acta Oncol,2012,51(1):69-76.

10 Pytliak M,Vargová V,Mechírová V.Matrix Metalloproteinases and their role in oncogenesis:a review[J].Onkologie,2012,35(1-2):49-53.

11 Bauvois B.New facets of matrix metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 as cell surface transducers:outside-in signaling and relationship to tumor progression[J].Biochim Biophys Acta,2012,1825(1):29-36.

12 Dolcet X,Llobet D,Pallares J,et al.NF-κB in development and progression of human cancer[J].Virchows Arch,2005,446(5):75-482.13 Xu L,Russu WA.Molecular docking and synthesis of novel quinazoline analogues as inhibitors of transcription factors NF-κB activation and their anti-cancer activities[J].Bioorg Med Chem,2013,21(2):540-546.

14 Yang XS,Liu SA,Liu JW,et al.Fucosyltransferase IV enhances expression of MMP-12 stimulated by EGF via the ERK1/2,p38 and NF-κB pathways in A431 cells[J].Asian Pac J Cancer Prev,2012,13(4):1657-1662.

15 Felx M,Guyot MC,Isler M,et al.Endothelin-1(ET-1)promotes MMP-2 and MMP-9 induction involving the transcription factor NF-kappaB in human osteosarcoma[J].Clin Sci(Lond),2006,110(6):645-654.

16 Shi MD,Shih YW,Lee YS,et al.Suppression of 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate-induced MCF-7 breast adenocarcinoma cells invasion/migration by a-tomatine through activating PKCa/ERK/NF-κB-dependent MMP-2/MMP-9 expressions[J].Cell Biochem Biophys,2012[Epub ahead of print].