陕西核桃栽培品种优系抗寒性评价

杨 惠，翟梅枝，李 丽，肖志娟

（西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100）

陕西核桃栽培品种优系抗寒性评价

杨 惠，翟梅枝，李 丽，肖志娟

（西北农林科技大学 林学院，陕西 杨凌 712100）

为选育抗寒能力较强的栽培品种，以香玲、西林3号、鲁W06-1、晋龙、清香、西洛3号、青7-2#、青-16#及青林等9个核桃栽培品种优系一年生休眠枝条为试验材料，分别测定了材料中组织含水量，以及经-10℃、-15℃、-20℃、-25℃、-30℃处理后材料相对电导率（REC）、丙二醛含量（MDA）、超氧化物歧化酶活性（SOD）、游离脯氨酸和可溶性糖含量。结果表明：随处理温度降低，枝条相对电导率和丙二醛含量增加，超氧化物歧化酶活性、游离脯氨酸和可溶性糖含量先增加后下降。9个品种优系的自由水与束缚水比值范围为0.83～1.61，半致死温度（LT50）为-17.196℃～-24.484℃，品种优系间差异显著。在-20℃处理下，鲁W06-1和晋龙的SOD活性快速增大至对照的2.5倍以上，游离脯氨酸浓度大于90 µg·g-1，分别为对照的2.31倍和3.05倍，抗寒性较强。根据隶属函数综合评价，9个品种优系的抗寒性强弱为：鲁W06-1＞晋龙＞清香＞青-16#＞西林3号＞青林＞青7-2#＞香玲＞西洛3号。

核桃；抗寒性；生理特性；隶属函数法

核桃Juglans regia L.又名胡桃，是我国重要的经济林树种，除北方严寒地区和少数省份外，其他26个省、市、自治区都有核桃分布。陕西作为全国核桃起源地之一，大部分地区都适宜核桃的栽培和发展，是我国核桃的主产省份[1]。近年，北半球冬季酷寒，全球冬季天气变冷，这样的寒冬可能将持续20～30年。研究表明在影响生长的8个环境因素中，极端低温、纬度和无霜期等对其生长影响较大[2]。近30年来，陕西晚霜冻害频繁，在渭北等严重的地区发生频率达到50%以上[3]，造成核桃严重减产甚至绝收。因此，对陕西核桃栽培品种优系进行抗寒性鉴定及筛选高抗寒能力品种具有重要意义。

在植物抗寒研究中，组织电解质渗出率是最常用的理化指标，同时应用logistic方程确定低温半致死温度可较准确的反映抗寒能力。此方法已在佛手[4]、扁桃[5]、马占相思[6]等植物研究中大量使用。韩玉虎等[7]分析了10个金薄香新品种与山西绵核桃的枝条电解质渗出率，推测金薄香4号和6号抗寒性相对较强；王勇等[8]表明-25℃处理时的枝条电解质渗出率可作为核桃抗寒性差异比较的参考。姜慧等[9]、杨途熙等[10]、夏清柱等[11]研究表明，组织自由水/束缚水比值、膜脂过氧化程度、渗透调节物质含量以及抗氧化酶活性等也与植物抗寒性系密切。相昆等[12]和刘广平等[13]分别对山东、辽宁部分核桃品系进行抗寒性研究，但对陕西核桃栽培品系的抗寒生理研究还未见报道。本研究拟通过对低温处理后枝条的相对电导率、丙二醛含量、超氧化物歧化酶活性、可溶性糖和脯氨酸含量等指标，以及对休眠枝条组织含水量的测定，应用隶属函数法对陕西9个栽培品种优系的抗寒性进行综合评价，以期为陕西核桃生产中选择抗寒品种优系提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及处理

以6个核桃良种（香玲、西林3号、晋龙、西洛3号、清香、青林）和3个优系（鲁W06-1、青7-2#、青-16#）为试验材料，于2011年12月中旬采自管理水平和立地基本一致的核桃园。选择均以普通北方核桃为砧木的4～5年生、长势一致各品种或优系5株，剪取生长部位一致、无病虫害的当年生核桃枝条。将采回的枝条剪成约30 cm长的小段，用自来水洗净，然后用蒸馏水洗3次，滤纸吸干，剪口封蜡。将每个品种或优系的枝条分成10份，每份5段，置于4℃冰柜中保存备用。低温处理时，每品种或优系取5份枝条，分别在-10℃、-15℃、-20℃、-25℃和-30℃温度下处理，以4℃·h-1匀速降温，达到处理温度后保持12 h，再控制相同速率匀速升温，至室温时取出，静置4 h后用于生理生化指标的测定，以4℃为对照。

1.2 生理生化指标测定

相对电导率的测定：参考岳海等[14]的方法，将各处理后的枝条剪成0.5 cm的小段，称取2.0 g装入锥形瓶中，加入20 mL去离子水，抽真空30 min后于25℃保温12 h，振荡混匀，用德国EC200便携式电导仪测电导值S1。再将其煮沸30 min，冷却测电导值S2。相对电导率=（S1－C）/（S2－C）×100%，其中：C为本底电导率值。重复3次。通过SPSS13.0软件拟合Logistic方程，并根据朱根海等[15]的方法计算半致死温度（LT50）。

枝条含水量、自由水/束缚比值的测定参照张志良等[16]的方法。

丙二醛（MDA）含量测定采用硫代巴比妥酸法；超氧化物歧化酶（SOD）活性测定用氯化硝基四氮唑蓝（NBT）光还原法；游离脯氨酸含量的测定用茚三酮比色法；可溶性糖含量的测定使用蒽酮试剂，4项指标测定参考高俊凤[17]的方法。

1.3 数据处理及综合评价方法

试验数据用SPSS13.0软件进行方差分析和聚类分析，采用隶属函数法进行综合评价，计算方法和公式参照司剑华等[18]的方法。

2 结果与分析

2.1 核桃枝条的组织含水量和自由水/束缚水比值

植物组织中的水分以自由水和束缚水两种状态存在，其含水量以及自由水/束缚水含量比值常与生命活动及抗性密切相关。休眠期枝条含水量较低，代谢缓慢以适应低温环境。且自由水与束缚水的比值越小，一方面低温下细胞内可形成冰晶的自由水含量越小，另一方面束缚水参与细胞结构组成，能稳定原生质，比例越大，抗寒性越强，因此常用自由/束缚水比值来评价植物抗寒性[19]。

由表1可知，9个品种或优系的枝条含水量、自由水和束缚水含量差异不显著，但自由水/束缚水比值差异显著（P＜0.05）。晋龙、青7-2#、清香3个品系的自由水/束缚水比值小于1，晋龙的比值最小为0.83，说明低温寒害时，其细胞内结冰和细胞脱水的程度可能小于其他品种或优系，抗寒性较强。其他6个品种或优系的自由水/束缚水比值均大于1，其中西洛3号的比值最大，为1.61。在冬季休眠时期，西洛3号细胞内自由水含量多，比例大，推测其枝条的抗寒性较差。

2.2 低温胁迫对核桃枝条相对电导率、膜脂过氧化以及SOD酶活性的影响

低温胁迫对植物细胞的主要影响是造成质膜透性改变甚至破坏，引起内含物外泄[20]。图1显示，在处理温度范围内，随温度的降低，核桃枝条相对电导率增大，整体呈现“S”型曲线变化趋势。其中，西洛3号在低温处理时，相对电导率较其他品系大，而清香相对电导率均较小，说明低温处理对不同品种优系细胞膜的破坏程度不同。相同温度处理下，相对电导率越小说明质膜受到的影响越小，抗寒性越强，所以初步判断清香的抗寒能力强于西洛3号。

表1 不同核桃品种优系组织含水量、自由水和束缚水含量及其比值Table 1 Water content and ratio of free water to bound water among different walnut cultivars and superior lines

图1 低温处理下核桃枝条相对电导率变化Fig. 1 Changes of relative electric conductivity in twigs of 9 cultivars and superior lines in low temperature

何小勇等[21]研究表明，将植物组织相对电导率拟合logistic方程，得到的拐点温度越低，表示半致死温度越低，植物抗寒能力越强。由表2可以看出，9个品种优系拟合度极显著，并且6个品种优系的R2大于0.99，说明它们配合logistic方程曲线的效果很好。根据拟合方程，鲁W06-1、青林、晋龙的半致死温度均低于-20℃，其中鲁W06-1最低，为-24.483℃。其他6个品种优系的半致死温度较高，尤其青7-2#和西洛3号的半致死温度均高于-18℃。经聚类分析，将9个核桃品种优系的抗寒性初步分成强、中等和弱三类：鲁W06-1和青林抗寒性较强，晋龙、清香、青-16#、西林3号及香玲的抗寒性中等，青7-2#和西洛3号的抗寒性较弱。

表2 核桃枝条相对电导率的logistic方程和LT50及聚类分析Table 2 Logistic equation according to relative electric conductivity and LT50 with cluster analysis

除相对电导率外，测定膜脂过氧化产物MDA含量及SOD活性也能够较好地反映细胞对低温胁迫的应答[9,14,22]。本研究结果显示，随处理温度的降低，核桃枝条丙二醛（MDA）含量总体上升，除西洛3号和鲁W06-1，其他品种优系均表现出“先上升后下降再上升”的趋势（图2）。在-15℃处理下，青-16#和青林的MDA含量较高，但-20℃时其含量分别迅速降低到-15℃的47.71%和51.01%。与大部分品种优系不同，西洛3号在-20℃处理时的MDA含量比-15℃增加51.72%，且其SOD酶活性较低，推测其抗寒能力较差。图2还显示，大部分品种优系核桃枝条中SOD酶活性呈现先上升后下降的趋势，在-20℃时出现最大值。清香、晋龙、鲁W06-1和其他品种优系相比，SOD酶活性较高，且分别为对照的4.45倍、2.86倍和2.52倍，表明这3个品种优系受到低温胁迫时抗氧化能力较强，推测它们的抗寒性较强。

综合分析认为，当处理温度为-20℃时，低温胁迫使细胞达到一个临界状态，大部分品种优系表现为SOD酶活性显著增大，抗氧化能力增加，有助于清除细胞内的活性氧，减少膜脂过氧化，降低MDA含量，维护质膜稳定。当温度继续下降时（如-25℃），细胞受到的胁迫超出自身耐受范围，SOD活性迅速下降，活性氧浓度增加，膜脂过氧化程度加剧，MDA含量上升，细胞膜透性遭受不可逆伤害。

图2 低温处理下MDA含量和SOD酶活性的变化Fig. 2 Changes of MDA content and SOD activities in twigs of 9 cultivars in low temperature

2.3 低温胁迫对核桃枝条中游离脯氨酸和可溶性糖含量的影响

游离脯氨酸和可溶性糖作为渗透调节物质，参与细胞水分的调节，减少细胞脱水，诱导植物的抗逆性[23]。在低温胁迫下，它们能够主动积累，提高植物的抗寒能力。

核桃枝条中游离脯氨酸含量随温度降低先上升后下降，不同品种优系变化趋势较一致。晋龙、鲁W06-1、西洛3号和清香4个品种优系的游离脯氨酸含量在-20℃出现最大值，而其他品种优系在-15℃处理后就逐渐降低。处理前，晋龙和鲁W06-1的游离脯氨酸含量较高，为其他品种优系的一倍左右；-20℃处理时，游离脯氨酸含量增大至90 µg·g-1FW以上，分别为其对照的3.05倍和2.31倍。当温度继续降低，游离脯氨酸含量迅速降低，分别至-20℃时的29.22%和26.42%。可溶性糖含量和游离脯氨酸含量变化趋势基本一致，各品种优系总体呈先上升后下降的变化，但不同品种优系达到最大值的处理温度不同，含量增加的幅度也不一样。清香的可溶性糖含量在-10℃出现最大值，为对照的1.97倍，而青7-2#在-15℃出现最大值，且仅为对照的1.3倍。

在低温胁迫环境，不同品种优系间细胞渗透调节物含量差异显著，且不同品种优系细胞渗透调节物质增加程度和随温度积累的速率也不同。由图3显示，-10℃处理时，6个品种优系的可溶性糖含量迅速增加达到最大值，游离脯氨酸含量变化较小；当处理温度继续降低，游离脯氨酸含量随温度降低而增加，但可溶性糖含量随温度下降而减小。由此推测，低温胁迫时，对低温较敏感的可溶性糖含量迅速增加，参与细胞渗透调节；当处理温度继续降低时，可溶性糖含量不再增加，游离脯氨酸含量快速增加，并代替可溶性糖成为主要的渗透调节物质；当处理温度达到-25℃，二者的含量与对照接近，细胞渗透调节能力迅速下降。

2.4 应用隶属函数评价抗寒性

图 3 低温处理下游离脯氨酸和可溶性糖含量的变化Fig. 3 Changes of free proline and soluble sugar content in twigs of 9 cultivars in low temperature

植物抗寒性是在低温环境中多因素综合表达、多个生理生化反应共同作用的结果， 所以综合与抗寒性相关的多指标进行评价，比单个指标评判抗寒性更具有科学性和可靠性[24]。对本研究6个指标采用模糊数学中的隶属函数法，计算各品种优系不同温度处理下各指标的隶属度，累加所有指标求平均隶属度来综合评价其抗寒性，平均隶属度越大表明抗寒性越强。

由表3可看出，鲁W06-1和晋龙综合隶属度大于0.6，抗寒能力强，西洛3号小于0.3，抗寒能力弱，其他6个品种优系均为中等抗寒品系。这与相昆等[12]评价其他核桃品系抗寒性的分级标准相同。按照综合评价结果，9个品种优系的抗寒性强弱为：鲁W06-1＞晋龙＞清香＞青-16#＞西林3号＞青林＞青7-2#＞香玲＞西洛3号。这与-20℃处理时9个品种优系MDA含量的分析结果完全相同，还与自由水/束缚水、相对电导率、SOD酶活性等其他指标分析结果基本一致。说明隶属函数法适用于核桃休眠枝条的抗寒性鉴定。

表3 不同核桃品种优系抗寒性综合评价Table 3 Integrated assessment of cold resistance of different walnut cultivars and superior lines

3 讨 论

质膜是细胞受到冻害的原初部位，其破坏程度直接反映细胞受到的伤害程度，所以常用电导法测定抗寒性。对核桃抗寒性的鉴定，常用低温处理后材料的电导率与煮沸后材料的电导率的比值表示相对电导率，有研究将相对电导率值接近50%的处理温度作为LT50分析[7-8,12-13]，也有研究拟合logistic方程求LT50，但拟合度较低[24-26]。朱根海等[15]认为，即使未受低温处理，组织在去离子水中浸提一段时间也会有电解质渗出，且不同材料存在差异，所以有必要消除本底的影响。本研究测定相对电导率时去除了本底电解质渗出率，9个品种优系对logistic方程的拟合度均极显著，且5个品系的R2达到0.99以上，求出的LT50在-20℃左右。该结果与相关记载[2]：“幼龄树在-20℃条件下出现‘抽条’或冻死”的结论一致。去除本底影响后，相对电导率对logistic方程的拟合度提高，且在拐点温度处理时，SOD活性和游离脯氨酸含量快速增大，MAD大幅下降，处于生理生化应答临界状态。由此说明，测定组织相对电导率时去除本底影响，再拟合logistic方程求出LT50，可以较好地评价核桃不同品种或优系的抗寒性。

可溶性糖和游离脯氨酸作为渗透调节物质，可以通过增加细胞的保水力来提高植物的抗寒性。游离脯氨酸亲水性强，能促进蛋白质水合作用，维持细胞结构、细胞运输和调节渗透压等，且一些研究表明，植物抗性强弱与逆境下游离脯氨酸积累量呈正相关，因此可以鉴定抗逆性[27]。但杨途熙等[10]研究认为，游离脯氨酸含量与抗寒性强弱并不是密切相关。本研究发现大部分品种优系的游离脯氨酸含量随温度的变化先增大后减小，抗寒能力较强的品种优系（如晋龙和鲁W06-1）最大值不仅远高于其他品种优系，而且为对照的3.05倍和2.31倍，而抗寒能力中等的品种优系（如香玲）最大值仅为对照的1.78倍。所以，游离脯氨酸含量可以作为核桃抗寒性的评价指标。作为另一种渗透调节物质，植物组织中可溶性糖含量与耐寒能力的获得密切相关[28]。可溶性糖随温度降低的变化趋势与游离脯氨酸相似，前者峰值出现的温度较后者峰值出现的温度高，说明植物细胞内可溶性糖对低温胁迫较敏感，一旦受到低温胁迫就迅速增加。前人[9,12,14]研究低温对植物的影响时，多将游离脯氨酸含量与可溶性蛋白含量结合起来分析调节物质的应答。本研究结果表明，核桃枝条组织受到低温胁迫后先积累可溶性糖，胁迫加大后积累游离脯氨酸，二者共同调节渗透压，提高枝条的抗寒能力。说明低温胁迫下游离脯氨酸和可溶性糖也能较好地反映细胞渗透调节变化情况。但这种调节方式在其他核桃品种或优系或组织中是否存在同样的情况还有待深入研究。

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Evaluation of cold resistance of walnut cultivars and superior lines in Shaanxi Province

YANG Hui, ZHAI Mei-zhi, LI Li, XIAO Zhi-juan

(College of Forestry, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling712100, Shaanxi, China )

In order to select high cold-tolerance walnut cultivars in Shaanxi Province, nine walnut cultivars and superior lines were studied, including Xiangling, Xilin NO.3, Lu W06-1, Jinlong, Qingxiang, Xiluo NO.3, Qing7-2#, Qing -16#and Qinglin. Annual branches of nine walnut cultivars and superior lines were treated respectively at -10℃ , -15℃, -20℃, -25℃ and -30℃ . The results show that the relative electric conductivity(REC) and malondialdehyde content(MDA) increased when the temperature became lower,while superoxide dismutase(SOD) activity, free proline and soluble sugar contents firstly increased then decreased; Among cultivars and superior lines there were significant differences in the ratio of free water content to bound water content and semi-lethal temperature (LT50),the ratio of free water content to bound water content was intervenient 0.83 and 1.61, and the range of LT50was -17.20 to -24.48℃;Under -20℃, SOD activity of Lu W06-1 and Jinlong increased rapidly to its maximum value that was over 2.5 times of the control group, and their free proline content was more than 90 µg·g-1, which was 2.31 times and 3.05 times of the control group respectively.According to a comprehensive evaluation based on subordinate function value analysis, their cold resistance from high to low was: Lu W06-1, Jinlong, Qingxiang, Qing-16#, Xilin NO.3, Qinglin, Qing 7-2#, Xiangling and Xiluo NO.3.

Juglans regia L. ; cold resistance; physiological property; subordinate function

S759.3

A

1673-923X(2013)04-0050-06

2012-12-11

国家林业公益性行业科研专项（201004027）

杨 惠（1988-），女，湖南常德人，硕士研究生，研究方向为植物抗寒生理生态

翟梅枝（1963-），女，河南西平人，博士，教授，主要从事植物病害生物防治、植物资源开发利用等教学与研究；E-mail：plum-zhai@163.com

[本文编校：吴 彬]