20种桉树及杂交种的花粉形态分析及分类学意义

武海霞，刘丽婷,2，廖柏勇，莫晓勇

20种桉树及杂交种的花粉形态分析及分类学意义

武海霞1，刘丽婷1,2，廖柏勇1，莫晓勇1

(1.华南农业大学 林学院,广东 广州 510642; 2.江西省林业科学院,江西 南昌 330032）

以20个桉树树种和杂交子代的花粉为研究对象，通过扫描电镜分析花粉显微结构特征。结果表明：（1）桉树花粉微观形态具有高度一致性，都属于小孢粉（10～25 μm）。极面观为钝三角形，赤道面观为椭圆形，属于三环孔沟类型。萌发沟细长，沟缘不整齐，直达两极汇合形成合沟或者副合沟，沟膜多为颗粒状纹饰。花粉外壁光滑或者具有纹饰。（2）桉树不同树种在花粉粒的大小、萌发器官及外壁纹饰的细微特征上均表现出明显差异，可作为桉树种间鉴别的重要手段。（3）花粉微观形态可作为分析亲本与杂交子代关系的指标之一，为杂交品种的鉴定与表现型预测提供科学依据。

桉树; 花粉; 显微结构; 分类

桉树Eucalyptus属桃金娘科Myrtaceaae，包含杯果木属Angophora Cav.、伞房属Corymbia K.D.Hill & L.A.S.Johnson和 桉 属Eucalyptus L’Hert[1]。根据目前公认的Hill & Johnson 分类系统[2]，桉树可以分为808个种和137个亚种，共945个种及亚种[3-4]。但因桉树被引种到自然分布区以外时，为了适应新的生态地理环境条件，表型形态特征会发生较大的变化。且伴随杂交、自交、回交等多重方式，因此直接通过表型性状分析进行桉树分类是有待考证的[5]。

花粉是植物系统发育过程中较保守的器官，不易受外部自然环境的影响，因此花粉形态具有较强的遗传保守性，即具有固定的形状、大小、表面纹饰和萌发器官特征[6-8]。花粉粒的形状、大小、外壁的形态结构具有种属特异性，花粉的变异程度往往标志着该类群的进化水平，因而被广泛用于属、种、品种间亲缘关系分析[9]。花粉微观形态分析操作简单，结果可靠性高，故被很多植物学家及分类学家采用[10]。目前，花粉形态特征分类与传统的形态特征分类结果的一致性得到植物学家的认可[11-12]，中国已有63.64%的裸子植物、36.36%的双子叶植物以及33.33%的单子叶植物进行了花粉形态的系统研究，涉及观赏植物、果树、林木、中草药等[13]。在研究植物分类时多被引用为重要依据[14]。

目前有关桉树多样性的研究都是从形态学及分子生物学角度来进行的，尚未有从花粉学的角度进行桉树形态演化规律方面的研究。关于桉属花粉微观形态研究仅有少量报道。Pike在1955年研究了桃金娘科71属300种的花粉[15]。中科院孢粉组观察了桃金娘科11属的15种花粉，桉属只有二色桉、赤桉、冈尼桉、纤脉桉等少数几个树种的花粉微观形态被简单报道过，没有深入地比较分析。目前为止，在中国广泛引种和推广种植的双蒴盖亚属横脉组和窿缘组树种的花粉微观形态研究尚未见公开报道[16]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验以华南地区广泛种植的粗皮桉E.pellita、尾叶桉E.urophylla、韦塔桉E wetarensis、细叶桉E.tereticornis及杂交种，共20种成熟花粉为研究对象，实验花粉的采集地点及时间见表1。

1.2 实验方法

1.2.1 扫描电镜观察法

新鲜花粉经FAA固定液固定24 h，进行50%、70%、85%、95%、100%、100%乙醇梯度脱水，醋酸异戊酯置换后经CO2临界点干燥。在解剖镜下将干燥后的花粉均匀地粘在样品台上，真空喷金镀膜后用SEM观察。

每个品种至少选取30粒花粉。测量正常花粉粒极轴长P、赤道轴长E、萌发沟长L、沟宽W、沟深D、萌发孔长A、萌发孔宽B；计算极赤比P/E、体积大小指数、极沟比L/P以及合沟区与花粉边长之比T、面积之比S，共12个定量指标；观察花粉的赤道面观、极面观形状、萌发器官和外壁纹饰特征[17]；选取有代表性的群体、赤道面、极面进行拍照。为一致起见，花粉的赤道轴长只在萌发孔的中心正好对着或者背离观察者的眼睛时才测量。

1.2.2 分析方法

采用等级数量编码方法进行性状编码，二元性状编号为0，1，定性多态性状按不同形态进行编号为1，2，…，n。数值性状取平均值直接进入下一步数学运算。计算时将各运算单位数值直接输入计算机中，利用SAS分析软件进行主成分分析，然后应用GenStat统计软件进行最小距离聚类分析[18]。

2 结果与分析

2.1 样品花粉的形态分析

对20个桉树树种及杂交子代的花粉扫描进行分析表明，多数桉树花粉呈黄色或者淡黄色，是辐射对称的扁球形单粒花粉（极赤比介于4∶8～6∶8之间）。根据Erdtman分级标准（以花粉最长轴的长度来表示），桉树花粉属于小孢粉（10～25 μm）。极面观为钝三角形，赤道面观为椭圆形。按照Erdtman的NPC分类系统（基于萌发器官的数目、位置和特征的分类系统）进行对照，桉树花粉应为N3P4C5型，即三环孔沟类型。萌发沟细长，沟缘不整齐，直达两极汇合形成合沟或者副合沟[19]。沟膜多为颗粒状纹饰；萌发内孔细长，位于赤道萌发沟中心，通过附近的外壁膨胀，也就是缘来体现。外壁光滑或者具有纹饰[13]。20个桉树树种及杂交子代的花粉在形状和外壁纹饰等方面的差异详见表2，扫描电镜图片见图1。

图1 桉树花粉扫描电镜图Fig.1 SEM photos on pollens of 20 Eucalyptus species and progenies

2.2 样品花粉的聚类分析

20个桉树树种及杂交子代花粉的10个定量指标及4个定性指标见表3。选择极轴长、赤道轴长、体积大小指数、萌发孔长、萌发孔特征、萌发沟特征、赤道面特征和极面特征8个指标进行最小距离聚类分析，得到谱系聚类图（见图2），聚类分析R2值分布见图3。据图将所有品系分成8类。粗皮桉单独成第1类；第2类由TU-1、UT-3、AK共3个杂交子代组成；第3类包含UT-5、UT-7、UT-9、韦塔桉、TU-3、W5、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4；尾叶桉和UG-1组成第4类；TU-2、细叶桉、UP-1、UT-2分别自成1类，为第5至第8类。

表3 20个桉树花粉样品指标Table 3 Pollens morphological characteristics tested of 20 Eucalyptus species and progenies

图2 桉树花粉微观形态聚类Fig.2 Clustering analysis of pollens ultra-morphology

图3 桉树花粉微观形态聚类分析R2值分布Fig.3 R 2 values distrbution of pollens ultra-morphology

在桉树谱系聚类图中可以直观的得到20个树种及杂交子代之间亲缘关系的远近和分类情况。根据表2的花粉微观形态特征描述，以花粉微观形态多样性为契点，可以快速地对上图中的各类花粉进行分类分析。

(1)粗皮桉、尾叶桉和细叶桉花粉可以很快鉴别出来。粗皮桉花粉是合沟花粉，尾叶桉花粉为副合沟花粉，细叶桉花粉同时具有合沟与副合沟，三者的遗传距离较远。除了萌发沟的形态之外，萌发孔的加厚程度、突起程度以及沟间区的纹饰和花粉粒的大小等也有明显区别，如粗皮桉的花粉沟间区为稀疏的浅穴状纹饰，萌发孔突起或者下陷；细叶桉花粉萌发孔内陷，缘显著加厚。这些都可以迅速将粗皮桉、尾叶桉和细叶桉花粉分到不同的类中。

(2)UP-1是尾粗桉花粉，同时具有合沟与副合沟，萌发孔微突起，具光滑的缘，微加厚。沟间区为脑纹状纹饰伴随深穴状纹饰，沟间极区或者合沟区的形状为凹弧三角形，在极区萌发沟的宽度发生变化。这些与众不同的形态特征，使得UP-1与亲本的遗传距离较远，自成一类。对于杂交后代来说，可以用超亲表达来解释。随之带来的生物学或其他方面的变异，还有待进一步研究。

(3)TU-2与UT-2是细尾桉与尾细桉花粉，亲本相同但父母本相异。直接影响结果是二者花粉微观形态的巨大差异。TU-2花粉萌发孔突起或者微凸起，具显著加厚的缘，呈突出的半椭球形，长轴与极轴方向相同。而UT-2的花粉萌发孔缘加厚不显著，但其同时出现突出与下陷的萌发孔。前者具有副合沟。副合沟与萌发沟的宽度相近。沟间极区形状不规则，表面为脑纹状纹饰。沟缘组成直三角形，内角约为60°。极区面积很小，仅占花粉总面积的3.6%。后者同时具有合沟与副合沟，极区结构更具有复杂多样性。同时参考其萌发孔长、极轴长等其他定量定性因子，这2种花粉之间以及它们与其他花粉之间遗传距离很远，彼此单独划成1类。

以上特点都可以快速地将各花粉区别开来。当然在聚类分析中也同时计算考虑了花粉体积大小的相关量化指标。

(4)第2类花粉的共同点是萌发孔突起，具合沟，合沟区表面光滑或者具有微小颗粒状纹饰，合沟区为凹弧三角形，内角小于或者等于60°。TU-1、UT-3和AK的花粉沟间区纹饰弱化，沟缘附近为穴状或浅穴状纹饰。合沟区具有颗粒状纹饰，凹弧三角形，弧度较大，三角形内角均小于40°。这一类花粉与粗皮桉的亲缘关系较近，与尾叶桉和细叶桉的亲缘关系较远，尤其是细叶桉。且TU-1、UT-3的萌发孔缘加厚不显著，AK显著加厚，故TU-1、UT-3亲缘关系最近，其次是AK。

(5)第3类中，UT-5、UT-7、UT-9、韦塔桉、TU-3、W5、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4花粉微观形态相近，外壁纹饰为脑纹状纹饰或者浅穴状纹饰，合沟区为凹弧三角形或直线三角形，内角在40°～60°之间。根据萌发孔缘增厚的情况，又可以进一步把沟缘显著加厚的UT-5与其他花粉区分开来。UG-1与尾叶桉虽然萌发孔和赤道面观特征与前三组接近，但萌发沟为副合沟，且沟间区形状不规则。

(6)AK为杂交子代，但亲本未知。从花粉微观形态可以看出，AK与TU-1、UT-3的亲缘关系较近，其次是粗皮桉。由此一方面可以推断，AK是尾叶桉、细叶桉的杂交子代，与TU-1、UT-3形态相似，与亲本的变异较大，属于超亲表达现象。另一方面，也可以推断其是粗皮桉的杂交子代。

(7)从聚类图中可以看出，韦塔桉和W5与UT-5、UT-7、UT-9、TU-3、UT-1、UT-6、UT-8、TU-4聚在一起，由此可以推断韦塔桉和W5与尾叶桉或者细叶桉具有亲缘关系。从遗传距离可以看出，二者与尾叶桉的关系更近一些。这与目前公认的观点相一致。

3 小结与讨论

(1)桉树的花粉微观形态具有一致性，表现为辐射对称的扁球形单粒花粉，极面观为钝三角形，赤道面观为椭圆形，属于三环孔沟类型。萌发沟细长，沟缘不整齐，直达两极汇合形成合沟或者副合沟。沟膜多为颗粒状纹饰；萌发内孔细长，位于赤道萌发沟中心，通过附近的外壁膨胀，也就是缘来体现。外壁光滑或者具有纹饰。

(2)不同树种在花粉粒的大小、萌发器官特征以及外壁纹饰的细微特征上均表现出明显差异，可作为桉树种间鉴别的重要依据。通过对20个树种和杂交子代的花粉进行电镜形态观察，建立桉树花粉微观形态学的量化指标。对桉树花粉的定量指标和定性指标进行最小距离聚类分析，得到桉树花粉谱系聚类图，直观反映出20个树种与杂交子代之间亲缘关系的远近和分类情况，与桉树植株表型分类结果基本一致，但内部也存在一定的差异。

(3)桉树花粉微观形态可作为分析亲本与杂交子代关系的指标之一，为杂交品种的鉴定与表现型预测提供科学依据。对16个杂交子代花粉的微观形态分析及分类表明，杂交子代与亲本的亲缘关系越近，遗传距离越小，可以据此推断优良无性系的亲缘关系。但另一方面，个别无性系的花粉形态与亲本的变异较大，属于超亲表达现象。

[1] 普赖尔，王豁然，约翰森.桉树分类[M].哈尔滨：东北林业大学出版社，1986：103-109.

[2] 王豁然.桉树生物学概论[M].北京：科学出版社，2010：334.

[3] 王豁然，布洛克.中国桉树检索表[M].北京：中国科学技术出版社，1991：74.

[4] 王豁然，江泽平,李延峻，等.格局在变化-树木引种与植物地理[M].北京：中国林业出版社，2005：277.

[5] 王豁然，郑勇奇.外来树种与生态环境[M].北京：中国环境科学出版社，2001：16.

[6] 熊 壮，曹福亮.银杏花粉研究进展[J].林业科技开发，2010，24(4)：6-9.

[7] 张双双，奚晓军.黑杨花粉活力和柱头可授性研究[J].安徽农业科学，2010，38(20)：10550-10552.

[8] 姜正旺，王圣梅.猕猴桃属花粉形态及其系统学意义[J].植物分类学报，2004，3(3)：245-260.

[9] 刘有春，刘威生，刘 宁，等.基于花粉形态数量分类的核果类系统关系研究[J].植物遗传资源学报，2010，11(5)： 645-649.

[10] 中国科学院植物研究所古生物研究室孢粉组译.孢粉学手册[M].北京：科学出版社，1978：429.

[11] Zavada M S, Lowrey T K.Comparative pollen morphology of brachylena, tarchananthus and two species of tubulifloridites(asteraceae) from the eocene, Knysna lignite of South Africa[J].Review of palaeobotany and palynology, 2010, 162(2)： 183-192.

[12] 蔡 丹，刘 军.四川金桂品种群桂花品种的花粉形态研究[J].江苏农业科学，2010，(2)：180-183.

[13] 赵先贵，肖 玲.中国植物花粉形态的研究进展[J].西北植物学报，1999，19(5)：92-95.

[14] Wang H, Mill R.Pollen morphology and infra-generic evolutionary relationships in some Chinese species of Pedicularis(Scrophulariaceae) [J].Plant systematic and evolution, 2003, 237(1-2)：1-17.

[15] 中国科学院植物研究所形态室孢粉组.中国植物花粉形态[M].北京：科学出版社，1960：181-183.

[16] Fan L K, Lu Y M, Yan G J, et al.Classification of Chinese wintersweet (Chimonanthus praecox) cultivars supported by pollen morphology[J].Agricultural sciences in China, 2010, 9(7)：958-964.

[17] 李 奎，王 雁，郑宝强,等.40个野生滇牡丹群体的花粉形态研究[J].北京林业大学学报，2011，33(1)：94-103.

[18] 朱 琨，张 璐，陈雅君,等.37个早熟禾品种的花粉形态及其分类学意义[J].草地学报，2011,19（1）：114-121.

[19] 宛 涛，孙启忠，蔡 萍,等.冷蒿正种与其变种的花粉形态观察[J].内蒙古农业大学学报，2011,32(1)：41-44.

[20] Mayer E, Cottsberger G.Pollen viability in the geneus silene(cayrophyllaceae)and its evaluation by means of different test procedures[J].Flora, 2000, 195(8)：349-353.

Pollen morphology and resuting taxonomic implications of 20 Eucalyptus species and progenies

WU Hai-xia1, LIU Li-ting1,2, LIAO Bo-yong1, MO Xiao-yong1
(1.Forestry College, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, Guangdong, China;2.Jiangxi Academy of Forestry, Nanchang 330032, Jiangxi, China)

Morphological and ultra-structure characters of 20 Eucalyptus species and progenies were examed by means of scanning electron microscop.The results indicate that Eucalyptus pollens were microspore(10～ 25 μm）and in a high consistence.Polar view was a obtuse triangle, equatorial view was ellipse，the germinal furrow long and thin, gully edge was not tidiness, then extens two polar together.Colpus membrane had more granular adorning; and the germinature inner hole slender in the middle of germinature furrow.The exine was smooth or had some fuzzy sculpture.The size of Eucalyptus pollen, germinature organ features and the fine-features in exine sculpture showed some significant differences in the different species of Eucalyptus, which could be important indexes of the relationships between the parents and their descendants, and can provide a scientific basis for identificating the species’ and predicting the species’ phenotype.

Eucalyptus; pollens; microscopic morphology; classification

S792.39

A

1673-923X(2012)03-0029-08

2011-12-15

广东省自然科学基金项目”抗桉树枝瘿姬小蜂基因的标记筛选及连锁分析”(粤科基字[(2010)03号])

武海霞(1986-),女,山东泰安人,硕士研究生,研究方向：林木遗传育种; E-mail：skyoflove860821@163.com

莫晓勇(1962-),男,四川达县人,教授,主要研究方向：森林培育和人工林经营; E-mail：xyscut2006@yahoo.com.cn

[本文编校：谢荣秀]