油茶花粉活力及柱头可授性研究

王湘南 ，陈永忠 ，王 瑞 ，朱朝阳 ，彭邵锋 ，陈隆升，马 力

油茶花粉活力及柱头可授性研究

王湘南1，陈永忠1，王 瑞1，朱朝阳2，彭邵锋1，陈隆升1，马 力1

（1.湖南省林业科学院, 湖南 长沙 410004；2.中南林业科技大学， 湖南 长沙 410004）

用TTC法测定油茶花粉散粉后的活力变化及寿命，用琼脂培养基萌发法测定了花粉萌发率，用联苯胺－过氧化氢法测定了柱头可授性。结果表明：油茶花粉活力在散粉8 h呈上升趋势，即散粉第1～2 天保持较高活力，随后活力开始下降，花粉寿命为4～10 d，最佳传粉期为开花后第1～5 天；油茶花粉萌发率是体现花粉活力的一个指标，结果略低于TTC法测定的花粉活力值，它是对TTC法测定花粉活力的补充和验证；油茶柱头可授性持续3～6 d，花苞在将开而未开时已具备一定可授性，开花第1～5天柱头可授性呈上升趋势，第5～10天可授性减弱至基本消失；与柱头可授性相比，花粉寿命相对长些，试验结果与所观测的单花开放寿命较相一致。

油茶；散粉；花粉活力；萌发率；柱头可授性

油茶Camellia oleifera 属山茶科山茶属，灌木或乔木[1-2]，主产我国，广泛分布于我国长江流域以南的l8个省(自治区)[3-4]，是我国南方主要食用油料树种，也是世界四大木本食用油料树种之一[5]，其种子榨得的油色清味香，油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸含量占90%左右，脂肪酸组成合理，营养丰富[3-4，6-9]，是一种优质保健的食用油。其茶籽粕和果壳含有茶皂素、糖类、粗蛋白、粗纤维等，可制成皂素、活性炭、糠醛、烤胶、饲料、肥料等多种化工产品[10-14]，是很好的化工、医药等原料，开发价值和潜力大。

花粉保持活力时间的长短和柱头可授期的长短结合在一起，严重影响着异花传粉植物的传粉成功率[15]。油茶花粉活力及柱头可授性有少量报道，如庄瑞林等[16]报道油茶花初开后花药全部开裂，第1、2天采集的花粉萌发率高，生活力较强，柱头具有受精能力的时间是开花后8～48 h；邓园艺等[17]报道油茶花在开花8 h后，其花粉活力（活性花粉所占百分比）达到最大值，第2天开始缓慢下降，柱头可授性在开花第2天达到最大，从第3天开始下降，第4天基本上没有可授性；何汉杏等[18]报道油茶开花授粉时间2～3 d；其它暂没发现油茶相关详细报道。

本研究对湖南油茶湘林系列、江西赣系列等无性系进行花粉活力和柱头可授性研究，探索油茶种质植物开花散粉后不同时间内的花粉活力和柱头可授粉性的变化规律，为提高其繁殖效率及其杂交育种和资源利用提供理论依据和参考资料。

1 材料与方法

1.1 材 料

试验材料取自湖南省林科院试验林场油茶种质资源收集圃。资源收集圃位于长沙市南郊，地理位置东经 113°1′，北纬 28°6′，海拔高度 80 ～100 m。土壤为第四纪酸性红壤，土层厚度50～100 cm，有机质含量1.57%，pH值4.8。气候属中亚热带季风气候，四季分明，春湿多变，夏季高温，夏秋常旱，全年无霜期约275 d，年平均气温16.8～17.2 ℃，年降水量1 422 mm。参试植株为大树高接换冠，树冠已完全恢复，平均树高2.5 m，平均冠幅4.2 m2。参试品种为湖南种源湘林系列和江西种源赣系列无性系，品种编号分别为湘林系列马1号、马3号、DZ1号和赣系列赣6号。花粉活力的测定：每品种各选定生长正常植株3株，分单株、不同批次采集测定。柱头可授性的测定：每品种选定多株生长正常、待开花苞多的植株。实验时间为2010年11月～2011年1月和2011年10月～11月。

1.2 方 法

采用氯化三苯基四氮唑法(TTC法)和琼脂培养基萌发法检测花粉活力和萌发率，用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性。

1.2.1 花粉活力检测

利用0.5%TTC（氯化三苯基四氮唑）溶液使有生活力的花粉变成红色，而丧失生活力或者败育的花粉则不显红色来测定花粉生活力[19-21]。具体方法是：将成熟待开花苞采集回实验室，待其完全散粉，取适量花粉于载玻片上，滴加1～2滴0.5%的TTC溶液涂抹均匀，盖上盖玻片，在保湿条件下于25℃恒温箱中培养0.5～2 h后进行镜检。每个样品做3个玻片重复，每玻片选取花粉粒分布均匀且数目不少于50粒的5个视野进行统计。结果计算公式为：R=(m1/m2)×100%。式中R为花粉生活力（%）；m1为视野中显红色或粉红色花粉粒数；m2为该视野中总花粉粒数。

1.2.2 花粉萌发率检测

参考何春燕等[20-26]筛选油茶花粉培养基萌发配方（1%琼脂+10%蔗糖+0.01%硼酸）进行试验。具体方法是：用玻璃棒蘸取适量加热融化的培养基液滴于单凹载玻片上，取适量花粉均匀播撒于培养基液表面，置于25℃恒温生化培养箱中培养，4 h后在Olympus10×10倍显微镜下观察花粉的萌发状况，镜检计数。每样品做5平行玻片，每玻片取3个视野，选取花粉粒数目不少于50粒且分布均匀的视野进行统计。计数以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准，24 h后仍未萌发的花粉粒定为不会萌发的花粉。结果计算公式为：A=(x/y)*100%。式中A表示花粉萌发率(%)；x表示视野中已萌发花粉数；y表示视野中花粉粒总数。

1.2.3 柱头可授性检测

用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性[27-30]。具体方法是：选择进入初花期成熟花苞多的油茶大树，于前一天下午选择成熟待开花苞200～300朵做好标记，在实验采样阶段每天8：00～17：00随时跟踪观察标记的花苞开花的进程并做好记录，于不同时间段每次采集样品10～15朵，将其柱头放人凹面载玻片中，滴加混合液（V联苯胺∶V过氧化氢∶V水＝4∶11∶22)，盖上盖玻片，镜下观察，若柱头周围反应液呈现蓝色并伴有大量气泡出现，则表示柱头具可授性，通过比较其气泡量的多少和大小来衡量其可授性的强弱。测定开花当天柱头可授性变化在花苞略微松动露缝、将开而未开阶段开始至完全张开的8 h内每隔0.5～1.5 h采样，其它根据开花不同时间于每天上午11：30或下午16：30左右采样，采样测定到柱头可授性消失为止。

2 结果与分析

2.1 花粉活力检测结果

取散粉第2、4、6、8 h的花粉进行TTC法花粉活力测定，测定结果表明：油茶花粉在散粉8 h期间，其活力一直呈上升趋势（见图1、图2），前4 h增幅较快，4 h后增幅趋缓，同品种不同植株间、同植株不同批次间采样测得的结果略有差异（图1、图2中A、B代表不同批次采样，数字代表不同株）。从图1，2可看出，花粉在散粉8 h其活力已基本趋于最大，部分显示仍具上升趋势。从图3、图4可看出：花粉散粉1～3 d其活力都保持较高水平，花粉活力为84%～91%；散粉第5 天马1号、马3号花粉活力分别为75.1%、69.3%，第7天、10天分别为55.5%、48.0%和58.3%、40.8%，第13天为32.6%和25.7%。

2.2 琼脂培养基花粉萌发实验结果

采用优化了的油茶花粉培养基进行花粉萌发实验（见图5），花粉管生长良好，马1号、马3号花粉萌发率与TTC法检测的花粉活力较一致，萌发率略小于TTC法检测的花粉活力值，两者的检测结果起到相互检验和修正作用。

图1 马1号离体水培散粉当天活力变化Fig.1 Pollen viability intraday varieties of Ma No.1 by water culture

图2 马3号离体水培散粉当天活力变化Fig.2 Pollen viability intraday varieties of Ma No.3 by water culture

图3 马1号花粉活力随散粉天数变化Fig.3 Pollen viability varieties of Ma NO.1 in the following days

图4 马3号花粉活力随散粉天数变化Fig.4 Pollen viability varieties of Ma No.3 in the following days

2.3 柱头可授性检测结果

从图6可看到：油茶花在将开而未开时柱头已具有过氧化物酶活性，即柱头已具备一定可授性。花苞从未张开至露缝张开而未全开的3 h内，柱头过氧化物酶活性增长缓慢，略有增加，变化不大。开花3 h后，过氧化物酶活性开始明显增强，在开花4 h时柱头可授性达当天最高值，随后缓慢下降，开花8 h时柱头可授性活力降至开花3 h左右的水平。从图7～10可看出：开花第1～5天柱头可授性呈上升趋势，随后迅速下降，第7～8天柱头可授性已较弱，第9～10天柱头可授性减弱至基本消失。

图5 马1号、马3号花粉培养基萌发Fig.5 Pollen germination in medium of varieties Ma No.1 and Ma NO.3

图6 马1号开花第1天（白昼）柱头活力变化（花期11中～1月下旬）Fig.6 Chapiter viability variety of Ma NO.1 in first day

图7 马1号开花柱头活力变化（花期11月中～1月下旬）Fig.7 Chapiter viability variety of Ma NO.1 in following days

图8 马3号开花柱头活力变化（花期11月上～12月下旬）Fig.8 Chapiter viability variety of Ma NO.3 in following days

图9 DZ1号开花柱头活力变化（花期10月中～11月下旬）Fig.9 Chapiter viability variety of DZ No.1 in the following days

图10 赣6号开花柱头活力变化(花期10月上中～11月中旬)Fig.10 Chapiter viability variety of Gan No.6 in following days

3 结论与讨论

（1）油茶花粉在开花散粉8 h期间其活力一直呈上升趋势，并且有继续上升的趋势。油茶一天当中开花时间不超过8 h，一般于开花第1～3天散粉，散粉快慢视开花时天气而定，晴、阴、下雨或温度、湿度高低不同以及种质不同在散粉快慢上都存在一定差异，有开花当天散粉完全和开花3 d仍不完全散粉的。一般冬季气温0～5℃或阴天时开花会推迟散粉或散粉不完全，花粉在户外低温下散粉1～3 d内都可保持较高活力，花粉寿命长可达10 d左右，最佳传粉期为开花后第1～5天。始花期11月上至中旬的较晚花品种其柱头可授性持续5～6 d，始花期10月上至中旬较早花品种柱头可授性持续3 d左右，不同种质存在差异。花期较早的种质花期和单花寿命相对要比花期较晚的要短。经过2008～2011年连续野外观察发现，江西种源种质赣6花期在10～11月，单花寿命3～4 d，花期35～45 d；湖南种源种质湘林马1号花期在11～1月，单花寿命6～10 d，花期60～90 d。除了花期气候对花期和单花开放寿命具有外在的影响外，花期不同的种质在长期生境影响下逐渐形成各自物候生长特性，已具有种质的遗传特性，引种的种质在不同的生境环境下会产生一定的适应性改变，不同地理种源种质物候生长的遗传特性对其有一定制约。

（2）柱头可授性在开花第1天呈先上升后下降的曲线形变化。柱头在花苞将开未开时已具有一定可授性，在花瓣开始张开的4 h上升至最高值，至5 h开始下降，开花7～8 h时柱头可授性降至初开3 h左右时的大小。推测这一变化应该与其开花时间段的天气光照变化以及植物内在生物钟的生长调节有关，与我们观测的单花开放动态结果相符，是其植物生物学特性的表现。经观察，油茶花一般于上午8：00～9：30开始开花，早上气温越低则开放得愈迟，11：30～16：00开放程度最大，此时花器各器官生活力处于一天中最旺盛时期，柱头可授性也最强，到了16：30～18：00，张开的花瓣会有所收拢闭合，至第2天上午8：00左右又重新开始张开，一般开花第1～3天会重复这一过程，因此早晚的柱头可授性会随之有所下降，即外界环境气温、光照对其产生一定日周期变化的影响。

（3）从现有文献看，还没发现柱头可授性检测中有一个具体可量化和很好地衡量柱头可授性等级的方法。本实验中根据柱头周围出现气泡的快慢、大小和数量来比较划分柱头可授性的强弱等级，这一方法存在一定的人为因素误差。为了准确划分和尽量减少误差，在实验中分析柱头检测的时间，认为以检测10～15 min时柱头冒出气泡的速度、大小和数量以及综合观察花柱外观形态色泽的变化来判断柱头可授性的强弱比较科学，结合实验观察和户外开花动态实物观测，相互对照综合得出结论会让实验结果更准确些。

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Pollen viability and chapiter receptivity of Camellia oleifera

WANG Xiang-nan1, CHEN Yong-zhong1, WANG Rui1, ZHU Chao-yang2, PENG Shao-feng1, CHEN Long-sheng1, MA Li1
(1.Hunan Academy of Forestry, Changsha 410004, Hunan, China;2.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China)

TTC method was utilized to determine the vigor change and life-span of the Camellia oleifera pollen after anther dehiscence;with agar medium germination method, the pollen germination rate was determined; and with benzidine-hydrogen peroxide method,the stigma receptivity was measured.The results show that Camellia oleifera pollen vigor showed a rising trend in 8 hours after anther dehiscence, within 1～2 days the pollen maintained at a high vigor level, then gradually declined, the life-span of Camellia oleifer pollen was around 4～10 days or so, and the best pollination period was 1 to 5 days after flowering; The rate of Camellia oleifer pollen germination is an indicator of pollen vigor, the determining value was slightly lower than the result of the TTC method, which is a kind of supplement and verification to TTC method in determining the pollen vigor; The stigma receptivity maintained for 3～6 days or so, but the best pollination period was about 5 days, among open in the bud and the un-blossomed the flowers already have a certain receptivity, flowering the first 1～5 days the stigma receptivity was rising, 5～10 days started to reduce until to basically disappeared;Compared with the period of stigma receptivity to pollen, life-span was relatively longer, the test results and the observation of a single flower opening life was consistent.

Camellia oleifera; anther dehiscence; pollen vigor; pollen germination rate; chapiter receptivity

S794.4

A

1673-923X(2012)03-0017-06

2012-01-10

湖南省科技厅科技计划重点项目“油茶优良种质资源遗传背景数据库建设与规模快繁技术研究”（2010FJ2010）；中央财政林业科技推广示范跨区域重点推广示范项目“油茶杂交新品种及丰产栽培技术集成示范”（[2011]TK074号）；林业公益性行业科研专项“油茶两系杂交种子园营建及高产培育技术研究”（200804044）

王湘南(1967—),女,湖南衡阳人,高级工程师,硕士,主要从事油茶育种栽培工作;E-mail：wangxiangnan04@yahoo.com.cn

[本文编校：谢荣秀]