芦丁的酶法转化及其产物异槲皮苷的分离

吴 迪,刘廷强,王东明,金凤燮,鱼红闪

(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034)

芦丁的酶法转化及其产物异槲皮苷的分离

吴 迪,刘廷强,王东明,金凤燮,鱼红闪

(大连工业大学 生物工程学院,辽宁 大连 116034)

利用微生物Absidia sp.R9g产的芦丁-α-鼠李糖苷酶(RhaR)转化芦丁制备异槲皮苷,采用硅胶柱层析法对酶解产物进行分离纯化。结果表明,24.0 g芦丁的酶解产物,经分离可得到较纯的异槲皮苷单体13.1 g,其得率为49.4%。通过高效液相色谱检测其纯度达到98.3%。

芦丁-α-鼠李糖苷酶；酶转化；异槲皮苷

0 引 言

异槲皮苷属于黄酮类物质,是芦丁的衍生物,仅比芦丁少一个鼠李糖,但其药理活性却明显高于芦丁。异槲皮苷具有抗炎、抗氧化、抗诱变等多种药理作用[1-2],并可有效地用于防治高血压、糖尿病、冠心病及神经衰弱等疾病[3]。异槲皮苷虽然在植物中分布较广[4],但是在这些植物中的含量却极低,如果从植物中直接提取,工作量较大、且得率较低,从而极大地限制了人们对其进一步的研究和应用。因此如何大量制备异槲皮苷成为了该研究领域的重要课题。

传统的工业化生产一般采用强酸对芦丁进行水解[5],该法不利于环境保护,且很难控制中间产物异槲皮苷的生成。另有研究从植物生物质中提取和纯化黄酮类物质,但此法需要昂贵的生物酶制剂,且工艺设备较复杂,生产成本高。

本实验室已经筛选出一种微生物菌株[6],该微生物能产生一种鼠李糖苷酶。此酶能够专一高效地水解芦丁分子上的鼠李糖基,生成产物异槲皮苷。此方法操作简单安全,并且整个过程反应便于控制,能大量生成中间产物异槲皮苷,产出量大,且产物纯度高。因此,利用酶法转化自然界中广泛存在且含量较高的芦丁,大量制备天然含量低、附加值高的异槲皮苷单体,具有重要意义,可以广泛应用于食品和工业。

1 材料与方法

1.1 材 料

芦丁、槲皮素、异槲皮苷样品,美国Sigma公司；菌种Absidia sp.R9g,大连工业大学生物工程学院菌种保藏所；薄层层析板(TLC),德国Merck公司。

1.2 方 法

1.2.1 粗酶液的制备

液体培养基配方：在12%的槐花浸出液中加入48%的麦芽汁,其余的40%用水补齐,最终制成麦芽汁浓度为5°的RhaR液体发酵培养基,121℃下湿热灭菌。

将Absidia sp.R9g接种于液体发酵培养基中,接种量为1～2环。然后将其置于全温振荡器中,在30℃、160 r/min的条件下培养菌体4～5 d。取发酵好的6 000 m L发酵液,用高速冷冻离心机在7 000 r/min下离心10 min,进而去除菌体,收集上清液；使用磁力搅拌仪,缓慢加入硫酸铵粉末至80%饱和度,在4℃下静置3～4 h；再离心,弃上清,收集蛋白质沉淀；沉淀用600 m L的0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac缓冲液溶解,在7 000 r/min下离心10 min,所得上清液即为粗酶液。

1.2.2 酶活力的测定

配制 10 mg/m L(0.02 mol/L pH 5.0 的HAc-Na Ac缓冲液0.8 m L加95%乙醇0.2 m L)的芦丁底物溶液,取0.1 m L底物溶液与0.1 m L粗酶液混合,50℃进行酶解反应8 h,然后加入0.2 m L的水饱和正丁醇终止酶反应；振荡、分层,取上层液作薄层层析检测,点样量为10μL,通过展开剂展开后在紫外下显色检测,应用Bandscan工具软件进行产物含量分析。

酶活力单位定义：在上述条件下,每小时生成1μg异槲皮苷的酶量为一个酶活力单位。

1.2.3 芦丁的酶转化反应

本实验组前期对该粗酶液进行了酶反应条件的优化,确定最佳底物质量分数为4%、最佳反应时间为8 h、最佳反应温度为50℃、最佳pH为5.0。在此基础上进行酶转化反应,准确称量24.0 g芦丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的HAc-Na Ac缓冲溶液和120 m L 95%的乙醇。然后加入600 m L酶液,混合后置于恒温50℃的反应釜中,搅拌反应8 h后终止酶反应。将反应液在7 000 r/min下高速冷冻离心10 min,然后对上清液进行浓缩、干燥,得到粗产品。反应后将酶液回收,重复进行5次酶反应以大量制备异槲皮苷。

1.2.4 产物异槲皮苷的分离纯化

利用硅胶柱层析对酶反应产物进行分离纯化。首先制备样品胶,将芦丁酶转化的酶解产物混合样品用于上样,用200 m L甲醇完全溶解。加入3倍样品质量的80～100目的硅胶,搅拌至颗粒均匀,在通风橱中的水浴锅上加热挥发至完全干燥。将厚度均匀的脱脂棉置于玻璃柱(φ8.2 cm×20 cm)底端,先装入15倍样品质量的300～400目的分离胶,抽真空使柱面平整,然后装入已经干燥好的样品胶,并于柱顶覆一层脱脂棉,保持柱面平整。最后对其进行洗脱,首先用纯氯仿打通硅胶柱,再用氯仿-甲醇洗脱剂(体积比为9.2∶0.8)对其进行洗脱,每次洗脱250 m L,由TLC检测监控洗脱过程,最后用纯甲醇将柱上残留的组分洗脱下来。洗脱完毕根据TLC检测结果,分类合并相同组分,将其浓缩干燥,称重。

1.2.5 高效液相色谱(HPLC)检测

采用高效液相色谱(HPLC)法对产品异槲皮苷进行纯度检测。色谱仪为Waters 2695高效液相色谱分析仪,利用 Waters 2996二极管阵列检测器及Empower色谱工作站对芦丁水解产物进行纯度检测。其中色谱条件为：中汇达的Kromasil C18反相色谱柱(φ4.6 mm×250 mm)；检测波长265 nm；体积流量1.0 m L/min；进样量10μL；柱温35℃。流动相为55%甲醇、45%水和0.4%的H3PO4混合液。

1.2.6 薄层层析(TLC)检测

将标准品和样品溶于甲醇中,用微量点样器吸取少量溶液,少量多次点在硅胶薄层层析板的起始线上,每次点样经电吹风风干后,将其置于盛有展开剂的层析缸中展开。当展开剂到达层析板上缘时,取出吹干表面溶剂,置于紫外分析仪中观察结果。参照标准品斑点位置确定样品中所含成分。所用展开剂的体积比为V(乙酸乙酯)∶V(丁酮)∶V(甲醇)∶V(水)＝10∶7∶1∶1。

2 结果与讨论

2.1 芦丁的酶转化反应

菌种Absidia sp.R9g经5 d恒温培养,80%的硫酸铵粉末沉淀,沉淀经0.02 mol/L pH 5.0的HAC-Na AC缓冲液溶解得到600 m L粗酶液。取0.1 m L粗酶液与0.1 m L底物溶液相混合,50℃进行酶解反应8 h,然后加入0.2 m L的水饱和正丁醇终止酶反应,振荡、分层,取上层液作TLC检测,并测定其酶活力为696.6 U/m L。TLC结果如图1所示,底物芦丁转化较彻底,转化率达到了95%以上。

利用此酶进行底物芦丁的酶转化反应。准确称量24.0 g芦丁,加入480 m L 0.02 mol/L pH 5.0的 HAc-Na Ac缓冲溶液和120 m L 95%的乙醇,然后加入600 m L酶液,混入恒温50℃的反应釜中,搅拌反应8 h后终止酶反应。将反应液在7 000 r/min下高速冷冻离心10 min,然后对上清液进行浓缩、干燥,得到粗产品质量为26.5 g。产物量比投料量大的主要原因是,在酶反应的过程中有少量的糖类、蛋白质以及色素等杂质生成。回收粗酶液再与24.0 g芦丁进行酶反应,重复进行5次,120.0 g的芦丁经酶转化得到粗产品128.5 g。

图1 芦丁-α-鼠李糖苷酶粗酶水解芦丁的TLC图谱Fig.1 TLC of rutin-α-rhamnosidase hydrolysis

2.2 产物的异槲皮苷分离纯化

取24.0 g芦丁酶转化产物的粗品,采用硅胶柱柱层层析法对其进行分离纯化,洗脱梯度为V(氯仿)∶V(甲醇)＝9.2∶0.8,每次收集250 m L,共洗脱35瓶,用薄层层析板点样跟踪,根据TLC结果,将相同组分合并收集并浓缩干燥。其中单点异槲皮苷部分质量为13.1 g,异槲皮苷的得率为49.4%,其TLC图见图2,其中第12～26瓶在板上显示为单点。

图2 硅胶分离产物的TLC图谱Fig.2 TLC result of separation by silica gel

2.3 高效液相色谱测定纯度

经硅胶柱分离得到的异槲皮苷单体,利用高效液相色谱对其进行纯度鉴定。取1.0 mg的样品,用甲醇定容于10 mL的容量瓶中,进样量为10μL,测定结果显示纯度为98.3%,HPLC结果见图3。

图3 异槲皮苷HPLC色谱图Fig.3 HPLC of isoquercitrin

3 结 论

由实验结果可以得出,利用Absidiasp.R9g菌产的芦丁-α-鼠李糖苷酶粗酶液,转化芦丁生成异槲皮苷的效果较为理想,反应时间短,转化率达到了95%以上,该酶液可反复回收利用多次,且酶活损失少。该法较传统的化学法有更多优势,不仅反应条件温和,对底物的选择性强,而且反应过程容易控制。总之,可以通过酶法简单方便地制备产物异槲皮苷,为实现工业化生产提供了理论依据。

[1]SOSA S,PACE R,BORNANCINA,et al.Topical anti-inflammatory activity of extracts and compounds fromHypericumperforatum L[J].Journal of Pharmacy and Pharmacology,2007,59(5)：703-709.

[2]SNIJMAN P,SWANEVELDER S,JOUBERT E,et al.The antimutagenic activity of the major flavonoids of Rooibos(Aspalathus Linearis)：some doseresponse effects on mutagen activation-flavonoid interactions[J].Mutation Research,2007,631(2)：111-123.

[3]王天仕,郑舍勋,魏高明.槐花对家兔体外心房肌的作用[J].山东中医药杂志,2002,21(5)：297-299.

[4]严安定,袁野,吴亮,等.HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量[J].安徽医药,2011,15(3)：296-297.

[5]孙兵,贡盈歌,舒晓宏,等.槲皮素制备方法的改进[J].大连医科大学学报,2008,30(1)：93-95.

[6]王侃,鱼红闪,金凤燮.芦丁-α-鼠李糖苷酶分离提纯及其酶性质[J].大连轻工业学院学报,2004,23(1)：30-33.

(WANG Kan,YU Hong-shan,JIN Feng-xie.Purification and characterization of rutin-α-rhanmosidase[J].Journal of Dalian Institute of Light Industry,2004,23(1)：30-33.)

The enzymatic transformation of rutin and the separation of the hydrolysate isoquercitrin

WU Di,LIU Ting-qiang,WANG Dong-ming,JIN Feng-xie,YU Hong-shan
(School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China)

Isoquercitrin was transformation from rutin by rutin-α-rhamnosidase(RhaR)produced with Absidia sp.R9g.Hydrolysate was separated from 24.0 g rutin by silica gel column and 13.1 g isoquercitrin was obtained.The yield was 49.4%and the purity of the product was 98.3%.

rutin-α-rhamnosidase；enzymatic transformation；isoquercitrin

Q556.2；Q946.83

A

1674-1404(2012)06-0399-03

2011-11-11.

辽宁省教育厅创新团队项目(2009T007).

吴 迪(1987-),女,硕士研究生；通信作者：鱼红闪(1968-),男,教授.