超声波破碎法提取发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶的条件优化

王 迪, 曹 方, 栾 静, 孙 玉 梅

( 大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

脂肪酶(EC 3.1.1.3)是一类能在油水界面上催化长链甘油酯水解和合成的羧酸酯酶[1],被广泛应用在油脂加工、食品、医药、日化等领域。微生物脂肪酶因其种类繁多,具有更广的作用pH、作用温度范围等优点得到了广泛的研究和应用[2]。发酵性丝孢酵母发酵产生的脂肪酶是胞内酶[3],细胞破碎是提取胞内脂肪酶的关键步骤,常用的破碎方法包括超声波法、高压匀浆法、研磨法和化学渗透法[4-7]。超声波细胞破碎是一种效果理想、条件温和的破碎方法,已广泛应用于微生物和植物细胞内蛋白质、糖类、核苷、油脂和酶类等物质的提取[8-12]。然而,超声波在细胞破碎过程中易引起特异性细胞壁的破坏、细胞液中高热量以及有害自由基的生成[13]。因此,研究最佳超声波提取条件对于最大限度的释放细胞内的活性物质,同时减少其损失具有重要意义。发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶的系统研究在国内尚未见报道。本文研究了超声波的输出功率、每次辐射时间、工作总时间、菌体质量浓度对发酵性丝孢酵母细胞破碎的影响,以获得较高活性脂肪酶的适宜提取条件,为该脂肪酶的后续研究奠定基础。

1 试 验

1.1 菌 种

发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans),CICC 1368,购自中国食品发酵工业研究院。

1.2 材料与仪器

78-1型磁力加热搅拌器,江苏金坛国华仪器厂；JYL-A010料理机,九阳股份有限公司；501型超级恒温器,上海市上海县试验仪器厂。

1.3 方 法

1.3.1 培养基及其制备

固体斜面培养基(g/L):葡萄糖20,酵母浸粉10,蛋白胨10,琼脂20,pH自然。于0.1 MPa灭菌15 min。

液体种子培养基(g/L):葡萄糖100,蛋白胨5.3,酵母膏2,尿素2,MgSO40.5,pH自然。除尿素外的其他成分于0.08 MPa灭菌20 min,尿素在0.05 MPa灭菌15 min。

发酵产酶培养基(g/L):葡萄糖100,蛋白胨1.8,酵母膏0.5,KH2PO42,植物油8.5,吐温80 4.6,pH自然。于0.08 MPa灭菌20 min。

1.3.2 培养方法

菌种活化:将4 ℃保存的酵母菌种接于固体斜面培养基上,于30 ℃培养48 h。

液体种子培养:取两环活化菌丝接入液体种子培养基中,于30 ℃、160 r/min摇床培养24 h。

菌体发酵产酶培养:向发酵产酶培养基中接入体积分数10%的液体种子,于30 ℃、160 r/min摇床培养60 h。

1.3.3 粗酶液的制备

将发酵液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min,收集菌体,用10 mL 、pH 6.8的磷酸盐缓冲液离心洗涤菌体2次,称取1 g菌体与25 mL、pH 6.8的磷酸盐缓冲液混合,于冰水浴中进行超声波破碎,将细胞破碎液于4 ℃、10 000 r/min离心10 min,收集上清液,上清液即为粗酶液。

1.3.4 脂肪酶活力测定方法

采用橄榄油乳化液法定量测定[14]。取两个100 mL三角瓶,分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中加入4 mL PVA橄榄油乳化液和5 mL、pH 6.8 的0.067 mol/L磷酸盐缓冲液,再于A瓶中加入95% 乙醇15 mL,于38 ℃水浴中预热5 min,然后于A、B瓶中各加入1 mL待测酶液,立即混匀,准确反应10 min,于B瓶中加15 mL 95% 乙醇终止反应。于空白和样品溶液中各加两滴酚酞指示剂,用0.01 mol/L NaOH溶液滴定水解产生的脂肪酸。

脂肪酶活力定义:在38 ℃、pH 6.8的反应条件下,将每分钟脂肪酶催化橄榄油水解产生1 μmol 脂肪酸所需酶量定义为一个活力单位。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波输出功率对脂肪酶活性的影响

选择超声波每次辐射时间为5 s、间歇时间为5 s、工作总时间为5 min,研究超声波输出功率对脂肪酶活性的影响,结果见图1。

图1 超声波输出功率对脂肪酶活性的影响

Fig.1 The effect of ultrasound output power on the lipase activity

由图1可见,脂肪酶活性随输出功率的增加先升高后降低。输出功率过小,不能有效破坏细胞壁,释放脂肪酶；增加输出功率,有利于空化泡的形成,从而增强破碎作用,但是输出功率过大,则会引起细胞液局部的温度和压力过高,降低脂肪酶的活性[15]。因此,选定超声波破壁的输出功率为500 W。

2.1.2 超声波每次辐射时间对脂肪酶活性的影响

选择超声波输出功率为500 W、间歇时间为5 s,工作总时间为5 min,研究超声波每次辐射时间对脂肪酶活性的影响,结果见图2。由图2可知,脂肪酶活性随每次辐射时间的增加呈现先升高后降低的趋势,每次辐射时间为6 s的脂肪酶活力最高。超声波的空化效应需要有足够的时间和更多的机会来完成,故短时多次的工作方式更有利于细胞破碎。每次辐射时间高于6 s,随着辐射时间的延长、辐射次数的减少脂肪酶活性降低。不过,每次辐射时间低于6 s,破碎率亦会明显下降,这可能是由于辐射时间太短,空化效应无法破坏细胞壁所致[16]。

图2 超声波每次辐射时间对脂肪酶活性的影响

Fig.2 The effect of ultrasound duration of irradiation each time on the activity of lipase

2.1.3 超声波工作总时间对脂肪酶活性的影响

选择超声波输出功率为500 W、超声波每次辐射时间为6 s,间歇时间为5 s,研究超声波工作总时间对脂肪酶活性的影响,结果见图3。由图3可见,脂肪酶活性随工作总时间的增加呈现先升高后降低的趋势,工作总时间增加到20 min的脂肪酶基本无活性。超声破碎时间过短(<5 min),不能有效地破坏酵母菌细胞壁,释放脂肪酶；而破碎时间过长(>5 min),不仅会产生较多热量,导致酶液失活,而且会使细胞中的大量杂质被提取出来,影响脂肪酶的纯度[17]。

图3 超声波工作总时间对脂肪酶活性的影响

Fig.3 The effect of ultrasound total irradiation time on the activity of lipase

2.1.4 菌体质量浓度对脂肪酶活性的影响

称取5份不同克数的菌泥与25 mL磷酸盐缓冲液混合,使得菌体质量浓度分别为20、25、30、50、100 g/L,置于冰水浴中,在超声波输出功率为500 W、每次辐射时间为6 s,间歇时间为5 s,工作总时间为5 min的条件下破碎菌体,研究菌体质量浓度对脂肪酶活性的影响,结果见图4。

图4 菌体质量浓度对脂肪酶活性的影响

Fig.4 The effect of cell concentration on the activity of lipase

由图4可知,脂肪酶活性随菌体质量浓度的增加先升高后降低,菌体质量浓度为25 g/L的酶活力最大。菌体质量浓度较低时,液体中总蛋白质的量较少,超声波在水中传递的损失较大,破碎效果较差；随着菌体质量浓度的增加,液体中总蛋白质的量增多,提取出的蛋白质量增大,处理液黏度增大,从而不利于空化泡的形成、膨胀和爆炸,导致破碎效果较差[18]。

2.2 正交试验结果

2.2.1 正交试验

在单因素试验的基础上,以脂肪酶活性大小为考察指标,采用L9(34)正交表,进行4因素3水平的正交试验。试验设计见表1,正交试验设计与结果见表2,方差分析结果见表3。

表1 L9(34) 正交因素设计水平表

表2 正交试验设计与结果

以表3的方差分析结果为依据,选择C(工作总时间)作为误差估计项,数据分析的结果表明,在所设计的水平范围内,B(每次辐射时间)和D(菌体质量浓度)对酶活有显著的影响(p<0.05)。各因素对酶活的影响程度依次为B>D>A(输出功率)>C,结合表2的K值可知,最佳提取条件为B2D2A3C3,即超声波每次辐射时间6 s(间歇时间5 s),菌体质量浓度为25 g/L,输出功率为550 W,超声波工作总时间5.5 min时破碎效果最好。

表3 方差分析

2.2.2 验证试验

采用正交试验确定的最佳提取条件B2D2A3C3,以脂肪酶活性为指标,进行验证试验。在此条件下3次测得酶活的平均值为128.46 U/g,高于正交试验结果的最大值,故认为正交试验得出的最优水平是可靠的。

3 结 论

通过单因素试验和正交试验确定提取发酵性丝孢酵母胞内脂肪酶的最佳工艺条件为:超声波每次辐射时间6 s(间歇时间5 s),菌体质量浓度为25 g/L,输出功率为550 W,工作总时间5.5 min。本研究为该脂肪酶发酵条件和酶学性质的后续研究奠定了基础。

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