RhoB抑制慢性粒细胞白血病细胞的生长

姚红，朱晓苏，徐康萍，周海侠，赵昀

(1.苏州大学唐仲英血液学研究中心，江苏苏州 215123;2.苏州大学附属第一医院血液科，江苏苏州 215006)

人类慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia，CML)是源自造血干细胞的恶性血液肿瘤。格列卫能缓解慢性期CML患者的症状，但单一药物尚不能治愈。寻找新的靶点、设计新药物已成为CML研究领域的热点［1］。哺乳动物Rho家族属于小GTP结合蛋白，包括22个成员［2］。其中RhoA，Rac1和Cdc42已被广泛研究。大量研究发现Rho蛋白调控癌细胞的增殖、存活、浸润与血管新生［3］。例如，RhoA、RhoC 以及Rac1、Cdc42 促进肿瘤形成、癌细胞侵袭和转移［4］。RhoB是Rho家族中较为特殊的一员，在实体肿瘤中则作为抑制子或负性调控子。脂类修饰是调控RhoB功能的重要方式之一，RhoB蛋白能进行法尼基(F)和牻牛儿基牻牛儿基(GG)两种修饰，这与多数其它Rho蛋白仅能进行一种类型的脂类修饰不同［5］。这些研究为实体肿瘤的治疗提供了新思路。但是，目前RhoB在人CML中的作用及其机制尚不明确。本研究使用慢病毒在人CML细胞中过表达RhoB，研究其对CML细胞增殖能力的影响;使用几种与RhoB脂类修饰相关的突变体研究RhoB是否需要脂类修饰行使其生物学功能及何种类型的脂类修饰是RhoB生物学功能所必需的;探讨RhoB及各种脂类修饰变体对CML细胞周期进程的影响，初步揭示RhoB对调控CML细胞生长的作用机制，为CML的治疗提供实验基础及理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人成巨核细胞白血病MEG-01细胞系(BCR-ABL阳性)购于上海中国科学院细胞库。CML患者骨髓样本来源于苏州大学附属第一医院。

1.1.2 主要试剂 Ex Taq DNA聚合酶、PMD19-T载体、T4DNA连接酶、EcoRⅠ、XhoⅠ、BglⅡ限制性内切酶均购于TaKaRa公司，碘化丙啶、RNase A和鼠抗人单克隆Actin抗体购于Sigma公司。PCR引物合成及基因序列检测均由上海生物工程公司完成。兔抗人RhoB多克隆抗体购于Santa Cruz Biotechnology公司。CD34细胞纯化试剂盒、纤粘连蛋白、甲基纤维素均购于StemCell Technologies公司。

1.1.3 主要仪器 流式细胞分析及分选仪(美国BD，Beckman Coulter)，紫外凝胶成像仪(美国 Bio-Rad)，垂直电泳仪和转印电泳仪(上海天能)，PCR仪(德国Biometra)，倒置显微镜(日本Olympus)。

1.2 实验方法

1.2.1 RhoB基因及其3个脂类修饰变体的克隆 参考NCBI网站公布的RhoB cDNA序列，设计如表1所示PCR引物［5］。PCR扩增出目的片段后使用T4DNA连接酶与PMD19-T载体连接，用BglⅡ将测序正确的目的基因切割纯化，再与线性化的Venus载体连接。用EcoRⅠ和XhoⅠ酶切鉴定连接正反向。

表1 RhoB基因及其3个脂类修饰变体PCR引物设计Tab 1 List of primer sequences

1.2.2 慢病毒的制备 将慢病毒表达载体通过磷酸钙沉淀的方式将其与其他3种包装质粒△R，VSV-G和Rev共转染293T细胞，收集转染后48和72 h的培养上清，0.22 μm滤膜过滤后进行分装，-80℃保存备用。将病毒上清进行1次超离心浓缩，获得超过100倍的浓缩病毒。

1.2.3 CML患者CD34+细胞的纯化与病毒侵染 将CML患者骨髓样本经密度梯度离心分离出骨髓单核细胞，利用免疫磁珠正向富集的方法纯化出CD34+细胞。细胞培养2 d后进行病毒侵染。先将浓缩病毒加到包被有纤粘连蛋白的96孔板中，4℃放置1～2 h后加入细胞，37℃共孵育12 h，PBS洗涤细胞3次后继续培养，72 h后进行流式分选，YFP+细胞用于实验。

1.2.4 细胞增殖和集落生成实验 细胞增殖实验:在24孔板中每孔种植5×104个YFP+细胞，培养的第3天和第6天分别进行细胞计数。集落生成(colonyforming cell，CFC)实验:在甲基纤维素中加入双抗、IMDM培养基和细胞，混匀后取1.1 ml接种到直径为3.5 cm小皿中，37℃培养，2周后进行集落计数。

1.2.5 细胞周期分析 取1×106YFP+的细胞，70%乙醇固定过夜，加入 RNase A(100 μg·ml-1)，37 ℃孵育30 min，再加入碘化丙啶(40 μg·ml-1)，流式细胞仪检测［6］。

1.2.6 蛋白质印迹法检测过表达的蛋白 收集2×106YFP+细胞，PBS清洗2次，加入蛋白裂解液，冰上裂解15 min，4℃ 14 000×g离心20 min，收集上清，进行蛋白定量。蛋白样品加入5×SDS加样缓冲液，100℃煮沸5 min，进行12%SDS-PAGE，转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，以合适的稀释比加入一抗4℃摇床过夜，TBST洗涤4次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，最后用 ECL试剂显影［7］。

1.3 统计学分析

所有实验均重复3次以上，数据采用GraphPad Prism 5.0处理。结果以±s表示，组间比较采用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基因克隆与载体构建

如图1A所示，基因测序结果证实我们成功获得野生型RhoB、脂类修饰缺失的变体RhoBC193G、只进行F修饰的变体RhoB-F(C-端残基CKVL突变为CAIM)及只进行GG修饰的变体RhoB-GG(C-端残基CKVL突变为CLLL)。并成功构建了表达RhoB及其变体的各类慢病毒载体，目的基因由SFFV(Spleen Focus Forming Virus)启动子驱动，YFP报告基因可示踪病毒转导的细胞(图1B)。蛋白质印迹实验显示RhoB及其变体均获得了成功表达(图1C)。

图1 基因克隆与载体构建A.Gene sequence data;B.Schematic structure of lentiviral vector;C.Western blotting to detect the protein expression Fig 1 Gene cloning and vector construction

2.2 RhoB抑制MEG-01细胞的增殖

如图2A所示，过表达RhoB后，培养第3天Venus组和RhoB组的细胞增殖并没有显著差异，而第6天RhoB组的细胞生长明显受到抑制(P＜0.01)。另外，在集落生成实验中RhoB组的细胞集落生成能力与Venus组相比受到显著抑制(P＜0.01)，抑制率约为45%(图2B)。

图2 RhoB对MEG-01细胞增殖能力的影响A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 2 The effect of RhoB on MEG-01 cell proliferation

2.3 RhoB抑制CML患者CD34+细胞的增殖

为了检测RhoB能否抑制CML病患CD34+细胞的增殖，随机选取3个CML初诊患者的骨髓样本并纯化出CD34+细胞进行集落生成实验。结果如图3所示，过表达RhoB后3个样本的集落生成能力与Venus组相比均明显受到抑制，平均抑制率约为90%。

图3 RhoB对CML患者CD34+细胞增殖能力的影响Fig 3 The effect of RhoB on the proliferation of CD34+cells from CML patients

2.4 RhoB抑制MEG-01细胞生长需要脂类修饰

为了验证RhoB在MEG-01细胞中行使的抑制功能是否与其蛋白的脂类修饰相关，我们构建了RhoB的脂类修饰缺失变体RhoBC193G。结果发现，过表达RhoBC193G后细胞生长速度几乎与Venus组细胞一致，细胞总数无明显差异(P＞0.05，图4A)。此外，RhoBC193G与Venus组相比集落生成能力也无显著差异(P ＞0.05，图4B)。

图4 RhoB抑制功能与其脂类修饰相关性A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 4 The association of the inhibitory effect of RhoB with its lipid modification

2.5 F修饰或GG修饰抑制MEG-01细胞的增殖

为了检测RhoB在MEG-01细胞中行使其抑制作用与哪一种脂类修饰相关，我们在细胞中过表达只进行F修饰或只进行GG修饰的RhoB变体。结果发现，这两种脂类修饰变体单独过表达都可以显著抑制细胞的增殖(P＜0.01，图5A)和集落生成能力(P＜0.05，图5B)。

图5 单一脂类修饰对MEG-01细胞增殖的影响A.Cell liquid culture;B.Colony-forming cell assayFig 5 The effect of mono-lipid modification on the proliferation of MEG-01cells

2.6 RhoB 阻滞MEG-01细胞于G2/M期

为了初步探索RhoB抑制MEG-01细胞生长的机制，我们利用流式细胞仪检测过表达RhoB及其变体后MEG-01细胞的生长周期进程。结果(图6)发现，分别过表达RhoB或RhoB-F、RhoB-GG后，处于G0/G1期的细胞与Venus组相比明显减少(RhoB 34.58%±2.29%，RhoB-F 34.65% ±0.22%，RhoB-GG 39.71% ±1.12%，Venus 46.68% ±0.96%，P＜0.05);而处于G2/M期的细胞则比Venus组显著增多(RhoB 30.16% ±2.05%，RhoB-F 33.3% ±1.58%，RhoB-GG 28.75% ±0.50%，Venus 18.21% ±1.59%，P＜0.05)。相比之下，RhoBC193G组无论是处于G0/G1期(47.32% ±0.61%)还是 G2/M期(18.11% ±0.84%)的细胞百分比基本与Venus组一致。这些结果说明RhoB将MEG-01细胞阻滞在G2/M期。

图6 RhoB及其脂类修饰变体对MEG-01细胞周期的影响Fig 6 The effect of RhoB and its mutants on the cell cycle of MEG-01 cells

3 讨 论

Rho家族成员中RhoB较为特殊。许多Rho蛋白在恶性转化方面起正向调控作用，而RhoB的功能却恰恰相反。研究发现RhoB在尿路上皮细胞癌、鳞状细胞癌中表达显著降低，并且在肺部肿瘤恶化过程中伴随有RhoB基因的丢失［8-9］。RhoB基因敲除小鼠出生频率、发育和寿命都正常，但是使用DMBA/TPA进行化学处理诱导形成皮肤肿瘤时，这些小鼠的成瘤率更高［10］。利用裸鼠皮下成瘤模型，在卵巢癌细胞中过表达RhoB可以抑制肿瘤的生长［11］。这些结果说明RhoB在实体瘤中可能是肿瘤抑制基因。但是RhoB是否在恶性血液病CML中同样行使抑制功能却不得而知。通过细胞增殖和集落生成实验发现，CML细胞中过表达RhoB后细胞的增殖受到明显抑制。结果表明CML细胞中RhoB依然行使抑制功能。

RhoB表达水平因细胞周期而异，RhoB转录本半衰期是30 min，这要远远比Rho蛋白家族其它成员短［12］。这就表明RhoB的功能要求它的表达受到严格的调控。其中一项重要的调控就是RhoB蛋白的脂类修饰，细胞中的RhoB蛋白被特异性地进行了两种脂类修饰，F修饰和GG修饰。不同类型的脂类修饰可能导致RhoB蛋白在质膜、核膜、晚期内涵体等亚细胞水平不同的定位。RhoB-F蛋白大部分定位在质膜上，RhoB-GG蛋白则主要定位在晚期内涵体中［13］。一些研究表明RhoB-F、RhoB-GG这两种脂类修饰形式具有不同的生物学功能。在Ras转化的小鼠NIH3T3成纤维细胞中，RhoB和RhoB-GG起到抗转化、抗增殖、诱导凋亡的作用［14］。而RhoB-F能够选择性地维持内皮细胞和经辐照处理的细胞的存活［15-16］。另外，RhoB，RhoB-F和RhoB-GG能抑制胰腺癌、宫颈癌细胞的生长［5］。本研究中，我们在MEG-01细胞中过表达RhoBC193G，发现失去脂类修饰后，细胞增殖与Venus组相比并无明显差异，表明脂类修饰是RhoB抑制MEG-01细胞增殖所必需的。MEG-01细胞中分别过表达RhoB-F和RhoB-GG后细胞增殖也同样受到抑制，表明单种脂类修饰仍然能够维持RhoB在MEG-01细胞中的抑制功能。另外，细胞周期检测发现RhoB，RhoB-F，RhoB-GG都可将MEG-01细胞阻滞在G2/M期，而RhoBC193G过表达的细胞周期进程却与Venus组细胞一致，表明RhoB蛋白的脂类修饰影响MEG-01细胞的周期进程，进而抑制细胞的增殖。

综上所述，本研究的功能学实验结果和细胞机制分析说明RhoB抑制CML细胞的生长，并且RhoB蛋白进行任何一种脂类修饰均能在CML细胞中行使抑制功能，同时经过两种脂类修饰或是单种脂类修饰的RhoB均可阻滞CML细胞于G2/M期。关于RhoB如何在MEG-01细胞中行使抑制功能进一步的分子机制还不明确，深入探索其分子机制将有助于CML治疗方法的研究和靶向药物的筛选。

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