人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

付晓达，高美华

(基础研究)

人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达

付晓达，高美华

目的 构建含有标签蛋白的人环指蛋白11(ring finger protein 11，RNF11)的真核表达载体，并观测其在293T细胞中的表达。 方法 使用MEGA5.0等生物学软件构建人RNF11的分子进化树;应用RT-PCR从4种人胃癌细胞系中检测到该基因的表达，并将其克隆到pEASY-Blunt载体中，酶切测序鉴定正确后，再将其连接到真核表达载体pCMV-HA中，酶切鉴定正确后转染293T细胞，Western-blotting测其表达。结论重组的携带有RNF11的真核表达载体酶切鉴定后显示载体及片段的大小正确，将该真核表达载体转染293T细胞后使用Western-blotting检测到了融合蛋白的表达。结果携带有标签蛋白的人RNF11基因的真核表达载体pCMV-HA-RNF11克隆及表达成功，为进一步研究其与其它蛋白质的相互作用奠定了基础。

环指蛋白;泛素连接酶E3:真核表达载体;胃癌

0 引 言

细胞在其生长发育的过程中受到了一系列生长因子的调控。正常的生长因子的调控对于机体来说是至关重要的。肿瘤等恶性疾病的发生发展与异常的生长因子表达、修饰密切相关［1］。泛素化修饰是机体蛋白翻译后加工修饰的一个重要途径，被泛素标记的蛋白质会被迅速的降解［2］。目前认为，蛋白降解过程的异常与肿瘤等恶性疾病密切相关。RNF11属于泛素连接酶E3家族成员。目前有研究表明，这一含有154个氨基酸的蛋白可能与生长因子的信号转导、泛素化修饰以及转录调节密切相关［3］。先前的研究认为，该蛋白能够直接活化转化生长因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)信号转导通路，从而可能在肿瘤生长过程中发挥了重要的作用［3］。之前的许多报道发现该蛋白高表达于乳腺肿瘤之中，从而印证了人们的这一判断［4］。我们通过生物学软件对从GeneBank中检索到的9种物种的RNF11的氨基酸序列进行比对，绘制出了该蛋白的进化树;同时通过GeneBank检索到该基因的已知序列设计引物，从多种胃癌细胞系细胞中检测到该基因的表达，并将其克隆于携带HA标签的真核表达载体之中，经测序证实，真核表达载体所携带的序列与GeneBank所报道的序列完全一致，这为进一步研究其在胃癌等其他肿瘤的发生发展过程中所发挥的功能奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验软件 氨基酸多序列比对使用Clustal 1.83完成，进化树使用MEGA 5.0完成。

1.1.2 实验细胞 人胃癌细胞系803、823、7901、AGS细胞系及人正常胃上皮细胞系GES-1由本教研室保存。

1.1.3 菌株与质粒E.coliTrans-T1感受态细胞与pEASY-Blunt克隆载体购自于北京全式金生物技术有限公司，pCMV-HA真核表达载体购自于Clonetech公司。

1.1.4 主要试剂 总RNA提取试剂Trizol购于Gibco，M-MLV逆转录酶购于Promega，T4DNA连接酶购于NEB，限制性内切酶EcoRⅠ、SalⅠ及高保真PCR聚合酶PrimeSTAR购于宝生物工程(大连)有限公司。Lipofectamine2000转染试剂购于 Invitrogen。兔抗HA多克隆抗体购于Clonetech公司，小鼠抗人β肌动蛋白抗体购于Sigma公司，辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG及辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠IgG购于碧云天生物技术研究所。

1.2 方法

1.2.1RNF11基因的多序列比对及进化树分析使用 NCBI Protein Datebase检索到 9个物种的RNF11氨基酸序列，使用Clustal 1.83进行多序列比对，显示出各物种间该蛋白的氨基酸序列差异。氨基酸多序列比对结果使用MEGA5.0软件绘制出进化树。

1.2.2RNF11基因在多种胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞系中的表达分析 使用Trizol试剂提取803、823、7901、AGS及GES-1的总RNA，经逆转录合成cDNA后使用RNF11的特异性引物扩增目的基因。同时扩增β肌动蛋白基因进行比较。

1.2.3 人RNF11基因的克隆 将冻存培养的人823细胞复苏后，培养至对数生长期，取约1×106细胞提取总RNA。将1ml Trizol试剂加入到上述细胞中，吹打混匀，直至细胞完全裂解，依步骤提取总RNA后，使用随机引物及M-MLV逆转录酶合成cDNA。设计RNF11全长基因读码框两端的引物，上游为:CTAGAATTCATGGGGAACTGCCTCAAATCC，并在其5'端引入EcoRⅠ酶切位点 GAATTC，下游为:CTGGTCGACTCAATTAGTCTCATAGGATGA，并在其5'端引入SalⅠ酶切位点GTCGAC;使用该引物扩增cDNA，将得到的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定结果满意后切胶回收纯化，并将该其连接至pEASYBlunt克隆载体中。转化感受态细胞，提取质粒鉴定正确后送北京华大基因测序，待测序结果回报正确后，将上一步得到的质粒以及pCMV-HA真核表达载体使用EcoRⅠ、SalⅠ行双酶切后电泳，将目的基因片段和载体回收后使用T4DNA连接酶连接。室温连接5min后转化感受态细胞。提取质粒酶切鉴定重组子，鉴定正确后扩大培养，提取质粒后备用。

1.2.4 使用Western-blotting法检测RNF11的表达 3复苏冻存的293T细胞，待细胞生长至对数生长期后接种6孔板，每空接种约1×105个细胞。待细胞贴壁后使用Lipofectamine 2000进行转染实验。转染48 h后收获裂解细胞，取适量的裂解液加入蛋白上样缓冲液沸水浴5 min后上样电泳。电泳结束后转移至大小适宜、经甲醇活化的PVDF上，转移结束后使用5%(M/V)脱脂奶粉封闭1 h。之后加入1∶1000稀释的兔抗HA多克隆抗体以及1∶2000稀释的小鼠抗人β肌动蛋白抗体室温孵育1 h。孵育结束后使用TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次5 min。之后加入1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG抗体以及1∶2000稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗小鼠IgG抗体，室温孵育1 h。孵育结束后再次使用 TBST溶液洗涤PVDF膜3次，每次5 min。洗涤结束后使用化学发光试剂盒显影，BIO-RAD Versal Doc成像设备下显影拍照。

2 结 果

2.1RNF11基因的多序列比对及进化树分析 使用Clustal 1.83软件将从NCBI Protein Datebase上检索到的9个物种的氨基酸序列进行比对后发现，不同物种间的氨基酸差异较小。使用MEGA5.0软件绘制出进化树后发现，该蛋白在进化上趋向保守，在各物种之间的同源性较高。见图1。

图1 RNF11在9种物种之间的进化树Figure 1 Phylogenetic tree of RNF11 in 9 species

2.2 RNF11在多种胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞系中的表达 使用上文所提及的RNF11的特异性引物在803、823、7901及AGS 4种胃癌细胞系中均检测到了该基因的表达，而在正常胃黏膜上皮细胞GES-1未检测到该基因的表达。见图2。

图2 RNF11在4种胃癌细胞系及正常胃黏膜上皮细胞系中的表达Figure 2 Expressions of RNF11 in gastric carcinoma and gastric epithelial cell lines

2.3 人RNF11基因的克隆 携带人RNF11基因的质粒pEASY-Blunt-RNF11及pCMV-HA-RNF11经EcoRⅠ、SalⅠ双酶切后均出现一条400bp左右的片段，测序结果经比对表明，该片段序列与GeneBank上公布的人RNF11基因序列完全一致;另一条较大的片段与载体供应商所提供的序列大小相符。见图3。

图3 人RNF11真核表达载体的构建Figure 3 Construction of the human RNF11 eukaryotic expression vector

2.4 人RNF11基因的表达 将重组pCMV-HARNF11质粒转染293T细胞约48 h，待RNF11基因充分表达后，使用Western-blotting方法检测RNF11的表达情况，同时检测β肌动蛋白表达进行对照。如图4所示，X线胶片上出现相对分子质量为42000的β肌动蛋白片段以及20000左右的目的片段。

图4 pCMV-HA-RNF11在293T细胞中的表达Figure 4 Expression of pCMV-HA-RNF11 in 293T cells

3 讨 论

泛素化修饰是机体蛋白翻译后修饰的一个重要途径，该途径在细胞的正常生长发育中发挥了重要的作用［5］，而且该途径往往是一个多聚化的过程。泛素化修饰作用中有3种关键酶即泛素活化酶E1 (ubiquitin activating enzyme)、泛素结合酶E2(ubiquitin conjugating enzyme)和泛素连接酶E3(ubiquitin-protein ligase)。泛素连接酶E3在蛋白泛素化修饰的过程中发挥了重要的作用，其主要的功能是募集特异性底物和E2，并介导泛素从E2转移到靶蛋白，从而决定了反应的特异性。目前的研究认为，RNF11属于E3泛素连接酶中的RING-finger家族成员，其与另一个亚家族，即HECT家族中的一些成员如Smurf1、Smurf2、AIP4以及Nedd4等都可能存在相互作用。同时有的学者认为RNF11与泛素结合酶E2以及泛素连接酶E3均能够发生相互作用［6］。有证据显示，RNF11与Smurf2的相互结合与其活化TGF-β信号的功能密切相关，目前认为这一功能的实现是通过抑制Smurf2阻断TGF-β的作用来实现的［7］。TGF-β具有促进肿瘤浸润及转移的作用，并且能够促进血管增生及抑制宿主免疫系统杀伤肿瘤细胞的功能［8］。抑制TGF-β信号转导通路在抑制肿瘤的生长与转移中有着重要的作用。

本研究从823等4种人胃癌细胞系中均检测到了RNF11基因的表达，并将其克隆到携带HA标签的真核表达载体之中，并且经测序证实得到的克隆序列与GeneBank上所收录的序列完全一致;先前关于该基因的研究报道发现其高表达于乳腺癌及前列腺癌细胞之中。通过本实验研究发现，该基因在多种胃癌细胞系中同样呈现高表达的态势。其在胃癌的发生发展的过程中所起到作用值得我们进一步的研究探讨。

HA标签是一种广泛应用的标签蛋白，其分子量小，抗原性高，易于检测。本文所使用的pCMV-HA载体能够较为简便地在目的蛋白的N端前携带上HA标签。这种融合蛋白能够被特异性的HA抗体所识别，从而广泛地应用于目的蛋白纯化、便于使用免疫共沉淀等手段鉴定其与其他蛋白的相互作用等研究。

之前有研究者使用酵母双杂交等高通量的手段鉴定出RNF11蛋白可能与77种蛋白在细胞内存在相互作用［9］。本研究将人RNF11克隆至携带有HA标签的真核表达载体，为进一步研究其在胃癌等肿瘤的发生发展中所发挥的作用以及其在细胞生长因子信号转导中所发挥的作用奠定了基础。

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Cloning and expression of human ring finger protein 11

FU Xiao-da，GAO Mei-hua
(Department of Immunology，Qingdao University Medical College，Qingdao266071，Shandong，China)

Objective The purpose of this study was to establish a eukaryotic expression vector containing human ring finger protein 11(RNF11)，and analyze its expression in 293T cells. Methods We constructed a phylogenetic tree of human RNF11using MEGA5.0，identified the expression of the RNF11 gene from four human gastric cancer cell lines，and inserted it into the pEASY-Blunt cloning vector.After enzyme digestion and DNA sequencing，the target gene was subcloned into the eukaryotic expression vector pCMV-HA.Following restriction enzyme digestion，the plasmid was transfected into 293T cells，and its expression identified by Westernblotting. Results The recombinant eukaryotic expression vector carrying RNF11 showed the correct length after the identified by the enzyme digestion，and the expression of the fusion protein was identified by Western-blot after transfecting the vector into 293T cells.Conclusion The construction and the expression of pCMV-HA-RNF11 were achieved successfully，which has prepared the experimental ground for further studies of RNF11 and its interaction with other proteins.

Ring finger protein;E3 ubiquitin-protein ligase;Eukaryotic expression vector;Gastric carcinoma

Q591.2

A

1008-8199(2012)01-0031-04

266071青岛，山东省青岛大学医学院免疫学教研室［付晓达(医学硕士研究生)、高美华］

高美华，E－mail:meihuagao@yahoo.com.cn

2011-04-18;

2011-06-17)

(责任编辑:李风华;英文编辑:罗永合)