促性腺激素及IL-6 对卵巢癌细胞株增殖作用的影响*

刘建红

(天津市第三中心医院，天津 300170)

卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一，因其解剖位置较深和症状不明显，是转移早且确诊晚的极具恶性度的肿瘤。由于该肿瘤易复发且对化疗药物存在耐药性，使得患者5 年生存率很低，仅为30 %左右。卵巢癌80% ～90%来源于卵巢表面上皮细胞，其病因不明，一般认为与内分泌、环境、遗传等多方面因素有关。近些年来，针对激素和上皮性卵巢癌(epithelial ovarian carcinoma ，EOC)之间关系的研究颇多，一般认为上皮性卵巢癌为激素依赖性肿瘤，激素在上皮性卵巢癌的病因和辅助治疗中发挥重要作用。随着分子生物学和现代免疫学的发展，细胞因子与肿瘤之间的作用机制为了解肿瘤的发生、转移提供了新的思路。本实验探讨促性腺激素、细胞因子和上皮性卵巢癌的关系。

1 材料与方法

1.1材料人卵巢低分化乳头状腺癌细胞株(OVCAR-3)和人上皮性卵巢癌细胞株(Caov -3)均购自美国ATCC。OLYMPUS CK2 倒置式生物显微镜(日本OLYMPUS)、302 -01 型CO2孵箱(美国NATIONAL APPLIANCE COMPANY)、Microplate reader Model 550(美国BIO - RAD COMPANY)。FSH、LH、hrIL-6、抗-IL-6 抗体、四甲基偶氮唑蓝(MTT)(sigma)购自北京舒伯伟公司;二甲基亚砜由苏州第二化工研究所生产。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 各取对数生长期卵巢癌细胞悬液(2 ×105/ml)加入96 孔板中，每孔100 μl，每组6 孔，37 ℃，5%CO2，饱和湿度培育24 h 弃去培养基，更换含有10%活性炭吸附的胎牛血清RPMI 1640 或DMEM培养基培养24 h，以去除原胎牛血清所含激素对细胞生长的影响。加入相应的刺激因素:①加入不同终浓度的FSH 和LH(20、40、60、80 和100 IU/L)和不同终浓度FSH+抗IL-6 中和性抗体(50 μg/ml)的培养基200 μl;②加入不同终浓度hrIL -6(20、40、60、80 和100 μg/ml)和hrIL -6 + 抗IL -6 中和性抗体(50 μg/ml)的培养基200 μl。分别设置6 个平行对照孔，另设6 个不加药的细胞培养基孔作为阴性对照，37 ℃培育96 h 后，在培养终止前4 h 加入MTT 溶液(5 mg/ml)，每孔20 μl，37 ℃继续培育4 h，弃去培养液。

1.2.2 细胞测定 在上述细胞中分别加入二甲基亚砜，每孔100 μl，稍振荡后，置酶标仪上，在波长为490 nm 时测定吸光度(A)值。

1.2.3 计算细胞增殖率 细胞增殖率(%)=(实验孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)/(对照孔吸光度均值-空白孔吸光度均值)×100% 。

1.3 统计学处理 采用SPSS 软件包进行统计学分析，试验结果以±s 表示。用Excel 软件对所获得数据进行分析、处理图表。

2 结果

2.1 促性腺激素对卵巢癌细胞系的促增殖作用及抗IL-6 中和性抗体对促性腺性激素促增殖作用的影响FSH 可促进OVCAR-3、Caov-3 细胞增殖。当FSH浓度为40IU/L 时，OVCAR-3 细胞和Caov-3 细胞株较对照组细胞增殖率分别增加了35%和67.7%，两组比较，差异有显著意义(P ＜0.05);当FSH 浓度为100 IU/L 时，两种细胞增殖率较对照组细胞分别增加202%和192%，两组比较，差异有非常显著意义(P ＜0.01)。在卵巢癌细胞培养液中分别加入50 μg/ml 抗IL-6 中和性抗体，两种卵巢癌细胞的生长均有所减慢，见图1 和图2。LH 的结果与FSH 的结果类似。无免疫活性的兔IgG 单独与上述两种细胞株培育，对细胞的增殖无影响。

2.2 rIL - 6 对卵巢癌细胞株的促增殖作用 在hrIL-6终浓度为100ng/ml 时，OVCAR -3 和Caov -3增殖率分别为对照组的394%和381%。抗IL -6 中和性抗体可封闭此作用，见图3。无免疫活性的兔IgG单独与上述两种细胞株培育，对细胞的增殖均无影响。

图1 不同浓度促性腺激素对OVCAR-3 的促增殖作用

图2 不同浓度促性腺激素对Caov-3 的促增殖作用

图3 hrIL-6 对卵巢癌细胞系的促增殖作用

3 讨论

1977 年Besedovsky 等［1］提出“神经内分泌免疫网络”学说，认为内分泌和免疫系统在功能上是一个整体，两组之间互相作用，互相制约，对肌体功能实施精密的调节，是肌体重要的调控系统。其共同的调节因子就是神经肽和激素［2］。为了探索原发上皮性卵巢癌中神经内分泌免疫网络调节功能的变化及其在卵巢癌发生发展中的作用，检测了①正常卵巢组织、良性卵巢肿瘤组织和恶性卵巢癌组织中促性腺激素受体(FSHR)的表达情况。②促性腺激素(卵泡刺激素、黄体生成素)、hrIL-6 及抗IL -6 中和性抗体对卵巢癌细胞系OVCAR-3，Caov-3 细胞增殖的影响。③促性腺激素(卵泡刺激素、黄体生成素)、hrIL -6 及抗IL -6 中和性抗体对卵巢癌细胞系OVCAR -3 和Caov -3细胞核转录因子NF-kB 表达的影响。

长期以来，有两种关于卵巢癌发生的假说已逐渐被人们接受，①高促性腺激素假说:持续的高促性腺激素对卵巢上皮的直接刺激或类固醇激素合成后的直接刺激，增加了恶变得可能;②持续排卵假说:垂体促性腺激素周期性刺激排卵，造成卵巢上皮反复损伤，再增殖修复过程中有丝分裂对卵巢上皮的长期、反复刺激，最终导致细胞的恶性转化。两种假设均在流行病学上得到支持。流行病学调查资料发现:妊娠、哺乳、口服避孕药可以降低卵巢癌发生的危险，这与抑制排卵及垂体促性腺激素分泌有关。Whittemore［3］发现使用促排卵药物的妇女发生上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤的危险是有不孕史妇女的3 倍和4 倍。促排卵药物可直接或间接地使促性腺激素超过生理循环浓度。性腺发育不全或两性畸形患者长期受高水平促性腺激素的刺激，发生卵巢癌的几率也会增加。另外，使用蓄积促性腺激素释放激素拮抗剂的方法可以减低或遏制卵巢癌的发生率，其原理是此种拮抗剂可以抑制促性腺激素得释放［4］。卵巢癌的高发期在妇女绝经后10 ～20年内，而此时正是体内促性腺激素水平分泌升高时期。据报道促性腺激素可促进卵巢表面上皮及上皮性卵巢癌细胞增殖，抑制其凋亡，并在上皮性卵巢癌的发生、发展及肿瘤化疗耐药性中扮演重要角色。本研究中外源性 FSH 和 LH 可促进卵巢癌细胞株OVCAR-3和Caov - 3 增殖，这一结果证实了上述推断。

FSH 可参与卵巢上皮分化、增殖、恶性变以及卵巢癌细胞的生长［5］。如果改变卵巢癌患者体内的内分泌环境，可有助于提高手术或化疗效果，减少复发。而对高FSH 血症的绝经后妇女的内分泌进行调整，有可能减少卵巢癌的发生。本文选取2 个卵巢癌细胞株进行促性腺激素体外刺激实验，发现在促性腺激素FSH 和LH 的作用下，细胞株OVCAR -3 和6Caov -3 的增殖能力加强，呈剂量依赖性，与Viqar Syed 等［6］的研究结果一致。但也有报道［7］，在体外实验中FSH 对卵巢上皮性肿瘤的生长具有促进作用，而LH 却拥有抑制其生长的作用，产生这种差异的原因可能是所选用细胞株的不同。通常人们认为FSH 通过与其细胞表面G蛋白偶联受体FSHR 结合发挥对细胞的作用。近些年来，针对促性腺激素在上皮性卵巢癌中的调控机制研究颇多，发现促性腺激素可通过调节一些细胞因子、生长因子和蛋白激酶等对上皮性卵巢癌发挥调控作用。本实验着重探讨在卵巢癌的发生发展中促性腺激素和IL-6 的作用。

Viqar Syed 等［6］研究证实，利用促性腺激素刺激卵巢癌细胞株可增加细胞IL -6 及IL -6 受体的表达，同时发现其增殖加快，而且IL-6 抗体抑制这种促增殖作用。本实验虽然与Viqar Syed 等人所使用的细胞株不同，但也得出类似结果，说明IL -6 在卵巢癌细胞的增殖过程中起重要作用。IL -6 是一种具有多向性生物学效能的细胞因子，如诱导B 细胞分化和分泌抗体，激活T 细胞和造血细胞，诱导其他细胞因子产生等。正常卵巢上皮可持续分泌IL -6，在卵巢滤泡发育、周围血管鞘形成过程中，内皮细胞可表达IL -6 mRNA，介导血管形成;在周期性排卵过程中，IL -6 可刺激上皮增生，参与卵巢表面破裂口的修复过程［8］。基础研究证实，在卵巢癌细胞培养的上清液中可测出IL-6 活性及IL-6 受体(IL-6R)mRNA 表达，并可刺激细胞的增殖［9］，本研究证实了这一点，发现外源性hrIL-6 可促进卵巢癌细胞株OVCAR -3 和Caov -3的增殖。

总之，上皮性卵巢癌的发生与患者体内促性腺激素水平的异常升高以及各种细胞因子比例失衡有着密切的联系。本实验观察到促性腺激素及IL -6 对卵巢癌细胞系OVCAR -3 和Caov -3 具有促细胞增殖作用，另一个发现是抗白细胞介素-6 中和性抗体可部分抑制上述促细胞增殖。这些结果提示:体内促性腺激素异常升高在上皮性卵巢肿瘤形成的早期起到重要的作用，而一旦上皮性卵巢癌形成，激素与细胞因子共同影响其发展和转归。

1 Besedovsky H O，del Rey A. Immune -neuro -endocrine interactions:facts and hypotheses. Endocr Rev，1996 ，17(1):64

2 Blalock J E，Price V R，Reed C A，et al. Peptide hormones shared by the neuroendocrine and immunologic system. J Immunol，1985，135(2s):858

3 Whittemore A S. The risk of ovarian cancer after treatment for infertility.N Engl J Med，1994，331(12):805

4 Darcy V Spicer，Malcolm C Pike. Future possibilities in the prevention of breast cancer:Luteinizing hormone-releasing hormone agonists. Cancer Res，2000，2 (4):264

5 陈红，胡琢英，邓晓谷. 雌激素、孕激素及促性腺激素对卵巢癌细胞株H0 - 8910 体外生长的调控. 中山医科大学学报，2001，22(1):29

6 Viqar Syed，Marambaud P，Shioi J，et al. Expression of gonadotropin receptor and growth responses to key reproductive hormones in normal and malignant human ovarian surface epithelial cell. Cancer research，2001，61(9):6768

7 Wenxin Zheng，Bibert S，Jaquinod M，et al. Ovarian epithelial tumor growth promotion by follicle - stimulating hormone and inhibition of the effect by luteinizing hormone. Gynecologic Oncology，2000，76(1):80

8 Lidor Y J，Xu F J，Martínez-Maza O，et al. Constitutive of macrophagecolony-stimulating factor and production interleukin-6 by human ovarian surface epithelial cells. Exp Cell Res，1993，207(2):332

9 Nilsson M B，Langley R R，Fidler I J. Interleukin -6，secreted by human ovarian carcinoma cells，is a potent proangiogenic cytokine. Cancer Res，2005，65(23):10794