佛手挥发油对小鼠体内B16黑色素瘤生长的影响*

邵邻相， 高海涛， 成文召， 李 美， 徐 丽， 陈莹莹

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

近年来关于植物挥发油的抗肿瘤作用有不少报道，如欧当归［1］、髯花杜鹃［2］、百里香［3］、温莪术［4］、葡萄柚［5］等植物的挥发油均能使体外培养的癌细胞凋亡，抑制癌细胞增殖;柠檬香茅［6］、巴豆［7］、薤白［8］、白术［9］等植物的挥发油也可抑制小鼠体内移植瘤的增殖．佛手(Citrus medica L．var．sarcodactylis(Noot)Swingle)是芸香科柑橘属植物佛手柑的果实，具有理气化痰、健胃止呕、舒肝健脾等作用．已有佛手挥发油抗菌、抗炎症及体外抑制癌细胞增殖的研究［10-14］报道，但佛手挥发油对体内移植瘤作用的研究国内外鲜见报道．本实验重点研究了佛手挥发油对小鼠移植性B16黑色素瘤生长的影响，为抗肿瘤药物的研究开发提供依据．

1 材料和方法

1．1 实验动物及细胞株

C57BL/6J小鼠，清洁级，购于上海斯莱克动物中心，合格证号:SCXK(沪)2007-0005．B16黑色素瘤细胞株购于中国科学院上海细胞生物研究所．

1．2 主要药品和仪器

RPMI 1640培养基购于美国Gibcobrl公司;新生牛血清购于杭州四季青生物工程材料公司;青霉素和链霉素均为Sigma公司产品;环磷酰胺(CTX)购自江苏恒瑞制药有限公司;邻苯三酚购自上海集团公司;三羟甲基氨基甲烷、硫代巴比妥酸均购于杭州昊天生物技术有限公司．

3K18通用台式冷冻离心机为德国Sigma公司产品;Ultrospec 4000紫外/可见光分光光度计为英国Biochrom公司产品．

1．3 佛手挥发油的提取及其乳剂的制备

以鲜金华佛手为原料，用水蒸汽蒸馏法提取挥发油，再用无水硫酸钠干燥，即得到佛手挥发油．将2 g佛手挥发油加入到2 g吐温-80中，混匀，再慢慢加入生理盐水，定容到100 mL，滤过除菌，然后用含2%吐温-80的生理盐水稀释成质量分数为10，50和90 mg/kg的乳剂．

1．4 小鼠移植瘤模型的建立

将B16黑色素瘤细胞用含10%胎牛血清的1640培养基于CO2培养箱中培养，取对数生长期细胞，用无菌生理盐水配制成1×107mL-1的单细胞悬液，在C57BL/6J小鼠右侧鼠蹊部皮下接种0．2 mL该细胞悬液．取 B16黑色素瘤细胞在C57BL/6J小鼠体内稳定传代14 d的小鼠，引颈处死，75%乙醇溶液消毒后，在无菌条件下剥离肿瘤组织，在无菌培养皿中剪碎，加适量生理盐水研磨，200目细胞筛网过滤，制成细胞悬液．以4 g/L台盼蓝溶液染色计数，保证细胞活力大于95%，以无菌生理盐水调细胞浓度为5×106mL-1，立即将该细胞悬液0．2 mL接种于C57BL/6J小鼠右侧鼠蹊部，制成移植性荷瘤小鼠模型．

1．5 实验动物分组及药物处理

将雌雄荷瘤小鼠分别随机分成5组，雌性小鼠每组10只，雄性小鼠每组9只．阴性对照组:小鼠腹腔注射0．2 mL 2%吐温-80无菌生理盐水，连续注射14 d．阳性对照组:小鼠腹腔注射环磷酰胺100 mg/(kg·d)，按常规药理学的方法，仅第1天给药．佛手挥发油低剂量组、中剂量组和高剂量组:分别按10，50和90 mg/(kg·d)剂量给小鼠腹腔注射佛手挥发油，连续注射14 d．同时设雌鼠、雄鼠正常对照组(雌性每组10只，雄性每组9只)．

1．6 抑瘤率测定

每日观察各组小鼠的生长状况，并记录各组小鼠给药期间的体质量．给药14 d后，引颈处死小鼠，完整剥离肿瘤组织，称质量;并取出荷瘤小鼠及正常对照组小鼠的心、肝、肾组织，称质量后将其液氮速冻，再放入-70℃冰箱中低温保存备用．以

计算抑瘤率．

1．7 超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量测定

邻苯三酚自氧化法［15］测定超氧化物歧化酶(SOD)活性．MDA-TBA 比色法［16］测定丙二醛(MDA)含量．

1．8 统计方法

运用SPSS 13．0统计学软件进行统计分析，数据统计结果用x±s表示，以 P ＜0．05作为差异有统计学意义．

2 结果

2．1 佛手挥发油对荷瘤小鼠肿瘤生长的影响

从图1和图2可以看出，药物处理前3天肿瘤的生长速率相对较慢，之后生长速率加快，且阴性对照组小鼠移植瘤增长速率较其他组快．图1显示的是佛手挥发油对雌性荷瘤小鼠肿瘤生长的影响:阴性对照组和佛手挥发油90 mg/kg剂量组小鼠移植瘤的生长速率相对较快，阳性对照组小鼠的肿瘤生长速率最慢，佛手挥发油50 mg/kg剂量组小鼠移植瘤的生长速度显著小于阴性对照组(P＜0．01)，说明50 mg/kg剂量的佛手挥发油对肿瘤有明显的抑制作用．图2显示了佛手挥发油对雄性荷瘤小鼠肿瘤生长的影响:阳性对照组小鼠的肿瘤生长速率较慢，其他4组相比都无显著差异(P ＞0．05)．

图2 雄性荷瘤小鼠各处理组肿瘤生长曲线

图1 雌性荷瘤小鼠各处理组肿瘤生长曲线

2．2 佛手挥发油对荷瘤小鼠黑色素实体瘤的影响

如表1所示，雌性荷瘤小鼠给药各组实体瘤的质量均小于阴性对照组，其中:阳性对照组的瘤质量最小，与其他组相比差异均显著(P＜0．05);佛手挥发油50 mg/kg剂量组小鼠的瘤体大小显著小于阴性对照组(P＜0．01)，抑瘤率达47．2%．雄性荷瘤小鼠阳性对照组的瘤体最小，与其他各组相比，差异极显著(P＜0．01);佛手挥发油各剂量组小鼠的瘤体较阴性对照组均减小，但差异无统计学意义(P＞0．05)．这说明50 mg/kg剂量的佛手挥发油对雌性荷瘤小鼠有显著的抑瘤作用，各剂量佛手挥发油对雄性荷瘤小鼠的抑瘤作用不明显．

表1 佛手挥发油对雌雄性荷瘤小鼠B16黑色素实体瘤的影响

2．3 佛手挥发油对荷瘤小鼠心、肝和肾中SOD活性的影响

如表2所示，50 mg/kg剂量的佛手挥发油能极显著地提高雌性荷瘤小鼠肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)的活性(P＜0．01)，但不能提高雄性荷瘤小鼠肝脏中的超氧化物歧化酶活性;各剂量的佛手挥发油均能降低荷瘤小鼠心脏中超氧化物歧化酶的活性，且与正常对照组相比，差异均极显著(P＜0．01);各剂量的佛手挥发油均不能提高荷瘤小鼠肾脏中超氧化物歧化酶的活性．这说明50 mg/kg剂量的佛手挥发油能提高雌性荷瘤小鼠肝脏的抗氧化能力．

表2 佛手挥发油对荷瘤小鼠心、肝和肾中SOD活性的影响 103U·g-1

2．4 佛手挥发油对荷瘤小鼠心、肝和肾中MDA含量的影响

如表3所示，与正常对照组相比，各组荷瘤小鼠心、肝、肾中的丙二醛(MDA)含量都有增加的趋势．90 mg/kg剂量的佛手挥发油能使雌性荷瘤小鼠肾脏中的丙二醛含量增加，与正常对照组相比差异极其显著(P＜0．01)．50 mg/kg剂量的佛手挥发油能降低雌性荷瘤小鼠脏器中的丙二醛含量，但与阴性对照组相比无显著性差异(P＞0．05);它能使雄性荷瘤小鼠心脏和肾脏中丙二醛含量极显著增加(P＜0．01)．这说明佛手挥发油不能降低荷瘤小鼠心、肝、肾中丙二醛的含量．

表3 佛手挥发油对荷瘤小鼠心、肝和肾中MDA含量的影响 μg·g-1

3 讨论

近年来，体内外实验研究表明，植物挥发油具有明显的抗肿瘤活性．文献［17］研究发现，百里香挥发油对体外培养的人卵巢癌细胞株IGR-OV1及小鼠肥大细胞癌P815实体瘤有抑制作用．张卿等［8］研究表明，薤白挥发油能显著抑制体外培养的S180和H22细胞的增殖，对小鼠S180和H22实体瘤有显著的抑制作用．本实验室已研究发现，佛手挥发油能使体外培养的B16黑色素瘤细胞和MAD-MB-435癌细胞凋亡，抑制其增殖［10-11］．本实验结果显示，佛手挥发油能抑制小鼠B16黑色素实体瘤的生长，50 mg/kg剂量的佛手挥发油对雌性荷瘤小鼠的作用最明显，抑瘤率达47．2%．

超氧化物歧化酶可以特异性地清除超氧阴离子自由基(O-2)，在机体的氧化和抗氧化水平上起着极其重要的作用．如果O-2等自由基不能被及时清除，它们就会攻击生物膜脂质中的多聚不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化反应，生成丙二醛等脂质过氧化物．王海霞等［18］研究认为番茄红素具有抑制肿瘤生长的作用，可能与提高超氧化物歧化酶活力、降低丙二醛含量及减轻DNA损伤有关．本实验结果显示，50 mg/kg剂量的佛手挥发油能显著提高雌性荷瘤小鼠肝脏中的超氧化物歧化酶活性，提高了机体的抗氧化能力，从而抑制了肿瘤的生长．

佛手挥发油对C57BL/6J荷瘤小鼠的抑瘤作用及抗氧化能力存在着性别差异性．胡小静等［19］用昆明小鼠研究了晒青绿茶和普洱茶多糖的抗氧化活性，发现青绿茶多糖和普洱茶多糖均能提高雄性小鼠的总抗氧化能力，但对雌性小鼠作用不明显．而本实验结果显示，佛手挥发油能提高雌性小鼠的抑瘤率和抗氧化能力，对雄性小鼠的作用不明显．小鼠的抗氧化能力和抗肿瘤作用存在性别差异性的原因尚不明确，还有待于进一步研究．

综上所述，佛手挥发油具有体内抗肿瘤作用，这可能与佛手挥发油能使肿瘤细胞凋亡、提高小鼠自身的抗氧化能力有关．

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