一氧化氮合酶碱基多态性与缺血性脑血管病的关系

孟秀君 胥丽霞 林 巧 田 野 任玉峰 侯 华

(中国医科大学附属第四医院神经内科，辽宁 沈阳 110005)

缺血性脑血管病(ischemic cerebrovascular disease，ICVD)是严重威胁人类健康的常见病、多发病，其致病因素包括环境因素和遗传因素两大方面。遗传因素在ICVD发病过程中起着很重要的作用，家系及双生子研究表明ICVD具有遗传易感性〔1，2〕，脑卒中个体有特异性遗传构成倾向〔3〕。近些年来越来越多的研究发现一氧化氮合酶基因位点上第7外显子上G298A、启动子-786T＞C和第4内含子上4 b/a碱基多态性与ICVD有关。本试验探讨该基因位点上此三个基因位点与ICVD的关系。

1 材料与方法

1.1 对象 随机选取2011年3月至2011年6月就诊于我院的老年ICVD患者共138例为病例组，包括大动脉粥样硬化性脑梗死56例和小动脉闭塞性脑梗死(腔隙性脑梗死)82例，其分型依据中国肝素药物治疗急性缺血性脑卒中试验(OAST)分型〔4〕，诊断标准参照1995年中华神经科学会第四届全国脑血管病学术会议修订的各类脑血管疾病诊断要点。所有病例均经影像学检查(头CT或MRI)证实。排除标准:瓣膜性心脏病、房颤、近期心肌梗死、血液病、肿瘤、癫痫、自身免疫性疾病及由炎症、栓子、脑血管畸形或动脉瘤等引起的继发性脑卒中。病例组合并脑梗死68例(49.3%)，合并高血压98例(71.0%)，合并糖尿病29例(21.0%)，合并冠心病35例(25.4%)。对照组来自研究期间在我院进行体检的健康老年人群，有心、脑血管病或糖尿病病史者均予以排除，按年龄相差＜5岁，性别、民族相同与病例进行匹配，共100例。

所有研究对象均为汉族，彼此间无血缘关系。在本人知情同意情况下，对所有研究对象进行调查问卷来获取人口学特征和已知的危险因素，包括种族、年龄、性别、疾病史、吸烟、饮酒等。病例组与对照组研究对象的一般临床资料见表1。

1.2 方法

1.2.1 血样采集 受检者空腹12～15 h，于次日晨8时采外周静脉血10 ml分装3个管，2个管加入乙二胺四乙酸二钠(EDTA)进行血常规测定(2 ml)和生化测定(4 ml)，1管用于DNA提取(4 ml)。血生化检测指标包括肝功能、肾功能、总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)等。所有检测均采用国际通用方法和标准试剂，在我院检验科完成。血液样本在4℃条件下保存。

1.2.2 DNA的提取 采用快速氯仿异戊醇法提取DNA(采用天根DP318-03公司提供的微量DNA提取试剂盒)，提取的DNA样品分装后放于-20℃保存。

1.2.3 引物 eNOS基因位点G298A的引物:正向:5'-CAT GAG GCT CAG CCC CAG AAC-3';反向:5'-AGT CAA TCC CTT TGG TGC TCA C-3'。-786T＞C的引物:正向:5'-CAC CCA GGC CCA CCC CAA CT-3';反向:5'-GCC GCA GGT CGA CAG AGA GAC T-3'。4 b/a的引物:正向:5'-CTA TGG TAG TGC CTT GGC TGG AGG-3';反向:5'-ACC GCC CAG GGA ACT CCG CT-3'。

1.2.4 PCR-RFLP法检测基因型 20 μl PCR体系中，含有0.1 μg基因组 DNA 模板，2 mmol/L MgCl2，0.2 μmol/L 引物，200 μmol/LdNTP，以及0.5 U Taq酶。2×Taq PCR Master Mix购买自宝生物D512A。E298D和4b/a的PCR条件为:95℃ 3 min，之后按下述条件进行 35个循环(94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃45 s)，最后72℃ 10 min。取上述PCR产物5 μl在琼脂糖凝胶中电泳，10 μl PCR 产物中加 1 μl 10 × buffer和 0.5 μl Mbo I，37℃处理过夜，电泳检测;G等位基因为206 bp的条带，T等位基因为119 bp和87 bp的条带，而4b和4a等位基因分别为210 bp、183 bp。-786T＞C PCR条件为:95℃ 3 min，之后按下述条件进行 35 个循环(94℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 35 s)，最后72℃ 10 min;取5 μl PCR 产物电泳检测，10 μl PCR 产物加1 μl 10 ×buffer和0.5 μl Mbo I，37℃处理过夜，电泳检测;T等位基因片段长度为415 bp，而C等位基因为370 bp和45 bp两个片段。

1.3 统计学方法 应用SAS统计软件对所有数据进行分析，临床参数用s表示，计量资料和计数资料分别用t检验和χ2检验。基因型频率和等位基因频率差异采用χ2检验，采用Logistic回归平衡协变量〔吸烟、收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、TC及LDL、空腹血糖(FPG)〕计算OR值及其95%可信区间(CI)。

2 结果

2.1 两组的一般临床特征 两组进行了年龄和性别的匹配，有差异的危险因素有吸烟、SBP、DBP、TC及LDL。见表1。病例组同型半胱氨酸水平为(22.0±20.8)μmol/L。

2.2 内皮型氧化氮合酶 (eNOS)基因型在病例组和对照组的分布 eNOS上G298A，4b/a和786C在病例组和对照组之间均无统计学差异 (P＞0.05)，提示eNOS基因型在ICVD患者与健康人群中的分布无差异。将两组之间有差异的变量包括:吸烟、SBP、DBP、TC、LDL行多元非条件Logistic回归分析，结果显示两组之间仍然没有显著性差异 (P＞0.05)。见表2。

表1 两组一般临床资料比较(s)

表1 两组一般临床资料比较(s)

67.6±10.9 66.0±10.6 0.06 0.92 0.63～1.08男性〔n(%)〕 99(71.7)64(64.0)0.20 0.70 0.40～1.22吸烟〔n(%)〕 69(51.1)20(20.0)＜0.01 4.18 2.31～7.58饮酒〔n(%)〕 29(21.0)21(21.0)0.99 1.00 0.53～1.88 SBP(mmHg)149.2±20.9 121.2±14.4 ＜0.01 0.14 0.01～0.62 DBP(mmHg)86.6±11.3 67.3±8.5 0.02 0.35 0.25～0.74 TC(mmol/L)8.1±39.7 5.3±1.0 0.05 0.73 0.59～0.84 TG(mmol/L)1.6±1.4 1.5±1.1 0.57 0.79 0.68～1.40 HDL(mmol/L)1.1±0.3 1.3±0.2 0.75 0.78 0.60～1.70 LDL(mmol/L)3.0±1.0 2.3±1.0 0.04 0.44 0.34～0.68 FPG(mmol/L)%CI年龄(岁)因素 病例组(n=138)对照组(n=100)P值 OR值 95 6.0±1.5 5.8±1.6 0.37 0.83 0.58～1.35

2.3 eNOS等位基因在病例组和对照组的分布 三种等位基因在ICVD患者和健康人群之间的分布有明显差异。见表3。

表2 病例组和对照组eNOS基因型分布〔n(%)〕

表3 eNOS等位基因在病例组和对照组的分布〔n(%)〕

3 讨论

内皮一氧化氮(nitric oxide，NO)的作用有:维持血管内的血液流动、血管的舒张、自动调节、保持血管壁的完整性、抑制血管平滑肌细胞增生、抑制血小板聚集及血细胞黏附、趋化〔5，6〕。NO合酶(NOS)共有3种类型:内皮型、神经型及诱导型。eNOS存在于血管内皮细胞内，在正常机体内由此酶催化合成内皮NO，从而发挥促进血管舒张、抑制平滑肌细胞增生及血小板聚集等作用。eNOS催化L-精氨酸生成瓜氨酸和NO，因此，eNOS是NO合成的关键酶。eNOS基因位于人类第7条常染色体上，是一条长21 k、包含26个外显子的基因片段。人eNOS含有1 203个氨基酸，其基因为单拷贝，定位于染色体7q352q36，全长21～22 kb，包括26个外显子和25个内含子。第7外显子G894T突变使编码的第298位谷氨酸(Glu，等位基因G)被天门冬氨酸(Asp，等位基因T)所取代，使eNOS构象改变，从而使eNOS酶活性下降，NO生成减少〔7〕。第4内含子处27个碱基(GAATGTCTAGACCTGATGCAGGGGGTGAG)4次或5次串联重复，此处多数人的等位基因是5个重复序列(4b)，少数人为4个重复序列(4a)。正常人的基因型为4b，一些研究提示4a会增加脑卒中的患病风险〔8〕，而启动子-786位点上T-C等位基因的突变同样也导致NO生成减少。

尽管NO与内皮细胞的功能密切相关，但关于G298T与ICVD关系各研究结论各不相同。Elbaz等〔7〕对法国的研究提示eNOS Glu298AspT等位基因纯合子与脑梗死，尤其腔隙性梗死有关，并认为该基因遗传易感性与LDL存在协同作用;Saidi等〔8〕对北非突尼斯国ICVD的研究同样发现Glu298Asp等位基因在ICVD患者中具有较高的频率;Cheng〔9〕对我国人群的研究也发现了该基因与ICVD存在微小的联系，然而关于土耳其人〔10〕和高加索人〔11〕的研究却没有发现 Glu298Asp与 ICVD 之间的关联。本研究也发现，Glu298Asp与ICVD无明显相关，Glu298Asp的各基因型分布在病例组与对照组之间无明显差异。上述对不同人群的研究结论截然相反，可能为研究人群种族不同可能会影响研究结果。

关于4b/a与ICVD的关系，国内外的研究结论大相径庭，Tao等〔12〕的一项Meta分析发现4b/a等位基因在ICVD和健康人群中无差别，我国的一项研究发现4bb是脑血管病的保护基因〔13〕，Majumdar〔14〕虽然认为4b/a在15 ～45 岁 ICVD 患者与非ICVD患者之间无明显差异，但也提示4a是提示女性ICVD患者的危险因素。本研究同样提示4b/a在ICVD与健康人群中无差异性分布。这些不同、甚至相互矛盾的结论的可能原因在于除了样本大小不一之外，性别差异也是其影响因素之一。其具体的机制可能是:性激素可以通过eNOS发挥收缩血管和舒张血管的双重作用，eNOS可以催化内皮NO的生成，同时也能催化诱导性NO的合成，而后者不利于脑血流的调节及侧支循环的开放，甚至会加剧脑细胞损伤〔15〕，而这种变化是随着内环境的变化而变化的。

近些年来，启动子上-786T到C碱基的突变与ICVD的关系也是研究的热点之一。-786T到C碱基的突变会导致NO的合成下降〔16〕。Howard等〔17〕的研究发现，携带 -786TT 的黑人女性患缺血性脑卒中的概率是无此基因女性的3倍，而在白人女性中则没有发现这种联系。Munshi〔18〕对南印第安人的研究则发现4b/a与ICVD的发生存在明显相关，与健康人群比较脑卒中患者中4a等位基因频率较高。在中国人中也存在着这样的联系。Moe等〔19〕在新加坡人群中的研究也提出初次ICVD与NOS无明显关系，这与本研究结果一致。从上述的研究结论中可以推测，eNOS基因多态性不仅与种族相关，在不同性别人群中也可能存在差别，同时样本种类的选择也可能会影响到研究的结论。

本研究提示，吸烟、SBP、TC及LDL在病例组与对照组间存在明显的差异，这也预示作为脑血管病的危险因素，传统的环境因素在ICVD的病因中也许占据了更大的成份。

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