秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法的比较试验

徐文华，韩金涛，蔡 涛，辛小玲，白延琴，刘 超，辛亚平

反刍动物的瘤胃是一个极其复杂的微生物共生的生态系统，瘤胃微生物种类繁多，包括瘤胃原虫、瘤胃细菌和厌氧真菌，还有少数的噬菌体，其中细菌的数量在瘤胃中占有很大比例［1］。

瘤胃微生物的区系十分复杂，且常因饲料种类、给饲时间、个体差异等因素而变化。瘤胃微生物主要为细菌、原生动物（主要包括鞭毛虫、纤毛虫）、真菌，但在消化中以厌氧性纤毛虫和细菌为主，他们的种类和数量也最多。1g瘤胃内容物中，约含细菌150～250亿和纤毛虫60～100万，其总容积约占瘤胃液的3.6%，其中细菌和纤毛虫各约占50%（按容积计）。但就代谢活动的强度和其作用的重要性来说，则细菌远远超过纤毛虫［2］。

反刍动物瘤胃微生物一直是一个研究热点，但由于瘤胃是一个特殊的厌氧环境，采用传统的微生物培养不但耗时耗力，而且不能全面了解瘤胃微生物［3］。直接提取样品中微生物总DNA进行分析的方法，避开了纯培养的步骤，减少了处理时间，而且能对很多难培养的微生物进行分析。本试验采用珠磨法、反复冻融法、液氮研磨法、液氮研磨法结合CTAB法和SDS法提取DNA的效果进行了比较，并通过紫外吸收法鉴定，确定了一套更为简便快速地提取秦川牛瘤胃微生物总DNA的有效方法［4］。

1 材料与方法

本试验以秦川牛瘤胃为研究对象，比较秦川牛瘤胃微生物DNA各种提取方法的优劣，并选择最佳提取方法。

1.1 试验材料

秦川牛瘤胃液在陕西眉县秦宝牧业肉公司牛屠宰场取得，秦川牛瘤胃微生物DNA提取试验在西北农林科技大学国家肉牛改良中心实验室进行。

1.1.1 试剂 十六烷基三甲溴化胺（CTAB）、十二烷基磺酸钠（SDS）、蛋白酶K、琼脂糖、酚：氯仿：异戊醇（1∶1∶1）、Tris、异丙醇、液氮、氯仿、磷酸钠、70%冷乙醇，其他国产化学试剂均为分析纯级。

1.1.2 主要仪器 高速台式离心机、超声波破碎仪、电热恒温水浴锅、紫外分光光度计、研钵、电子天平等。

1.2 方法

1.2.1 操作流程 详见图1。

1.2.2 采样 采集瘤胃内容物及瘤胃液，混匀，然后四层纱布过滤，滤液10000g离心5min，弃上清，沉淀用生理盐水溶解，放置－80℃保存。

1.2.3 破碎方法 试验采用珠磨法等4种物理方法进行瘤胃微生物的细胞破碎，采用SDS和CTAB两种化学方法进行细胞破碎液的DNA提取，因此，本试验进行4×2＝8种提取方法的比较，每种方法均取样品450μL。

图1 秦川牛瘤胃微生物DNA提取方法比较

珠磨法：样品加入到装有0.3g玻璃碎珠的小型离心管中，高速离心，加入抽提液，反复离心取上清。

反复冻融法：样品中加入抽提液，放置液氮中2 min，然后迅速放置600℃水浴5min，此步骤重复3次，然后离心取上清。

超声波破碎法：样品中加入抽提液后，放置超声波破碎仪中，功率100w，破碎时间为5min然后放置冰浴2min，此步骤重复两次，然后离心取上清。

液氮研磨法：先将样品中加入适量液氮瘤胃微生物的采集与处理，采集瘤胃内容物及瘤胃液，混匀，然后4层纱布过滤，滤液10000g，离心5min，弃上清，沉淀用生理盐水溶液，放置－70℃保存。

1.2.4 DNA提取 珠磨－CTAB法：取秦川牛的瘤胃内容物及其瘤胃液1.5mL加入到装有0.3g玻璃碎珠的小型离心管中，在12000g的条件下离心5min，除去上清；加入1.5mL的PBS溶液在12000g的条件下离心5min，除去上清；加入800 μL CTAB Buffer（4g CTAB、16.364g NaCl、1 mol／L Tris·HCl，20mL pH 8.0、0.5mol／L EDTA 8mL，定容至200mL灭菌）Beat 120s在70℃条件下培养20min，然后在10000g条件下离心10 min将上清液转移到新的离心管中，加入5μL的RNA酶（10mg／mL）在37℃条件下培养30min；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）溶液振荡（15～30s）呈白色乳浊液13000r／min条件下离心10min，取上清加入到新的离心管中再用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提至界面清晰为止。加入0.8 mL的异丙醇轻轻上下混匀几次在室温条件下放置5min让DNA沉淀在－20℃过夜，在13000r／min条件下离心15～20min小心倒出上清可以看到灰白色的DNA沉淀加入750μL 70%的冷乙醇，将白色沉淀轻轻弹起在13000r／min条件下离心10～15min倒出上清，风干DNA加入100μL的TE Buffer（视沉淀体积而定）在70℃条件下5min，用分光光度计测定DNA的浓度［5］。

珠磨－SDS法：SDS buffer成分如下：100mmol／L NaCl、500mmol／L Tris.HCl PH 8.0、10%SDS，其他提取过程同珠磨－CTAB方法。

反复冻融－CTAB法：参照文献冻融法和 Murrav等提出的CTAB方法，将冻融法和CTAB法相结合步骤如下：取秦川牛瘤胃内容物及其瘤胃液0.5mL置于灭菌的2mL离心管中；加入400μL DNA抽提缓冲液（100mmol／LTris.HCI，pH 8.0；100mmol／L，DNA；100mmol／L磷酸钠缓冲液，pH 8.0；1.5mol／LNaCl；1%CTAB）充分混匀，置液氮中完全冻结温至融化；重复该步骤2次（液氮中冷冻约3～5min），取出在60℃水浴中保温至融化；重复该步骤2次，共3次；60℃保温1h，每隔15～20 min颠倒混匀几次；加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1），10000g，4℃离心10min；上清液转移至一新的离心管中，重复2次如上清液仍浑浊，可增加1次；上清液中加1／10倍体积3mol／L乙酸钠（pH 7.0）及2倍体积冷无水乙醇，轻轻混匀，置于－20℃过夜；10000g，4℃离心15min；沉淀用70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次，自然干燥；沉淀用100 uL TE，（pH 8.0）溶解；将其 DNA 原液进行稀释后，取3μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA纯度，用分光光度计测定DNA的浓度其余DNA置于－20℃下保存备用。

反复冻融－SDS（蛋白酶K）法：取秦川牛瘤胃内容物及其瘤胃液0.5mL置于灭菌的2mL离心管中；加900μL SDS提取液（100mmol／L NaC1，500 mmol／L Tris.HCl pH8.0，10%SDS），置液氮中完全冻结温至融化；重复该步骤2次，（液氮中冷冻约3～5min），取出在60℃水浴中保温至融化；重复该步骤2次，共3次；加入120μL蛋白酶K（20mg／mL）60℃保温1h，每隔15～20min颠倒混匀几次；6000g室温离心10min；收集上清液，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1），10000g，4℃离心10min；上清液转移至一新的离心管中，重复2次。如上清液仍浑浊，可增加1次；上清液中加1／10倍体积3mol／L乙酸钠（pH 7.0）及2倍体积冷无水乙醇，轻轻混匀，置于－20℃过夜；10000g，4℃离心15min；沉淀用70%乙醇和冷无水乙醇各洗1次，自然干燥；沉淀用100μL TE，（pH8.0）溶解；将其DNA原液进行稀释后，取3μL在1.5%的琼脂糖凝胶上电泳，观察DNA纯度，用分光光度计测定DNA的浓度其余DNA置于－20℃下保存备用［6］。

液氮研磨－CTAB法：先将瘤胃液样品中加入适量液氮，在灭菌的研钵上快速研磨，然后加入抽提液CTAB Buffer（100mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸钠缓冲液，pH8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反复颠倒数次，然后离心取上清6000r／min，离心5min，取上清，加20mg／mL 蛋白酶 K 10μL，65℃水浴，30 min，然后再加等体积酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，12000g，4℃离心2min取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h，16000g，4℃离心10min，弃上清用70%乙醇洗涤沉淀，晾干用TE（pH 8.0，含10 mg／uL RNase）溶解，放置37℃水浴30min酚和氯仿抽提1次，12000g，4℃离心2min上清加2倍体积乙醇，过夜16000g，4℃离心10min，弃上清70%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶于 TE（pH 8.0）。

液氮 研 磨－SDS 法：SDS Buffer 成 分：100 mmol／LNaCl，500mmol／LTris.HCl pH 8.0，10%SDS。将瘤胃液样品中加入适量液氮，在灭菌的研钵上快速研磨，然后加入抽提液CTAB Buffer（100 mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸钠缓冲液，pH 8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反复颠倒数次，然后离心取上清6 000r／min，离心5min，取上清，加20mg／mL蛋白酶K 10uL，65℃水浴，30min，然后再加等体积酚：氯仿：异戊醇（25∶24∶1）抽提2次，12000g，4℃离心2min取上清加2倍冷乙醇，沉淀1h，16000g，4℃离心10min，弃上清用70%乙醇洗涤沉淀，晾干用TE（pH 8.0，含10mg／μL RNase）溶解，放置37℃水浴30min酚和氯仿抽提1次，12000g，4℃离心2min上清加2倍体积乙醇，过夜16000g，4℃离心10min，弃上清70%乙醇洗涤沉淀，晾干，溶于 TE（pH 8.0）［7］。

超声波破碎－CTAB法：取瘤胃样1.5mL；，样品中加入400μL CTAB抽提液，CTAB Buffer（100 mmol／L Tris·HCI，pH 8.0；100mmol／L EDTA；100mmol／L 磷酸钠缓冲液，pH 8.0；1.5mol／L NaCl；1%CTAB）反复颠倒数次后，放置超声波破碎仪中，功率100w，破碎时间为5min然后放置冰浴2min，此步骤重复两次，然后离心取上清。

超声波破碎－SDS法：取瘤胃样1.5mL，样品中加入加900μLSDS提取液（100mmol／L NaC1，500 mmol／L Tris.HCl pH 8.0，10%SDS），反复颠倒数次后，放置超声波破碎仪中，功率100w，破碎时间为5min然后放置冰浴2min，此步骤重复两次，然后离心取上清。

2 结果

秦川牛瘤胃微生物DNA的纯度及浓度检测结果见表1。

3 讨论

由表1可以看出，粗提的DNA的OD 260／OD 280比值大概在1.0～1.05之间，纯度都比较低，样品中含有很多杂质，须经进一步纯化以便后续应用；在珠磨法中，用CTAB抽提液获得的DNA浓度高于用SDS提抽液提取的DNA浓度。

在反复冻融法中，用SDS提取液的效果明显高于其它。在液氮研磨法中，所提取的DNA效果差异不明显，效率亦不高。在超声波法中，实际操作所获得的DNA提取效果差。

对不同方法提取的DNA样品进行电泳检测，上样量均为8μL。瘤胃微生物DNA片段分子量在20kb左右，表明己获得较大片段的瘤胃微生物基因组DNA。珠磨－CTAB法可以获得比较完整的瘤胃微生物总DNA片段，但是明显具有拖尾现象，而在加入CTAB提取液后，将样品放置65℃水浴几分钟，提取DNA的效果更好。珠磨－CTAB法的浓度均比其他方法高微弱，并且RNA仍未降解完全，同时在点样仍存在多糖和大分子不明杂质。珠磨－SDS法提取的DNA条带也明显具有拖尾现象，说明DNA降解严重。

表1 秦川牛瘤胃微生物DNA的纯度及浓度检测结果

通过条带可见反复冻融－SDS法提取的DNA的质量优于反复冻融－CTAB法，可以获得比较完整的DNA片段，并且在该方法的凝胶泳道前部，可见较亮的RNA谱带，说明提取物中存在未降解完全的RNA，需要进行下一步的纯化。

从DNA提取的效果看，同时在电泳点样胶孔中含有很多的多糖和大分子不明杂质，并且提取的DNA仍有一定的降解。

液氮研磨法与CTAB和SDS两种化学方法提取DNA条带亮度较之珠磨法和反复冻融法稍暗，有拖尾现象且RNA仍未降解完全，同时在点样仍存在多糖和大分子不明杂质，很难保证片段的完整性。

超声波法破碎细胞能力较之其他方法差，提取DNA用此方法效果一般。

4 结论

以秦川牛瘤胃微生物为对象，采用珠磨法、反复冻融法、液氮研磨法、超声波法提取DNA。从DNA提取效果来看，珠磨－CTAB法和反复冻融法可以获得相对比较完整的瘤胃微生物总DNA片段，纯化后的DNA含量高。

［1］李 旦，杨舒黎，等.瘤胃微生物总DNA提取方法的比较［J］.中国农学通报，2006，22（9）：1－5.

［2］刘 薇，方国庆，王志博，王艳等.奶牛瘤胃微生物DNA提取法的研究与优化［J］.中国畜牧杂志，2011，47（13）：71－75.

［3］杨瑞红，王加启，罗淑萍，等.奶牛瘤胃胃液微生物总DNA的提取和纯化［J］.新疆农业大学学报，2005，28（2）：39－42.

［4］淡瑞芳，龙瑞军，杨予海.瘤胃微生物总DNA快速提取法研究［J］.家畜生态学报，2006，（1）：18－21.

［5］鲍毅新，孙 波，张龙龙，等.对动物组织DNA提取力法的改进及PCR检测［J］.浙江师范大学学报（自然科学版），2009，（3）：30.

［6］杨舒黎，王加启，卜登攀.瘤胃微生物定量方法研究进展［J］.中国畜牧兽医杂志，2007，34（3）：5－8.

［7］隋昶生，王利华.崂山奶山羊瘤胃微生物总DNA提取方法的优化［J］.中国农学通报，2009，259（5）：18－21.