固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因多态性与肉用性状关系的研究

滑留帅，杨晓冰，杨 奇，胡沈荣，陈 宏＊

引言

固原市位于宁夏回族自治区南部山区，是一个历史悠久的肉牛基地。固原本地的黄牛品系，基本是陕西秦川牛的后裔或直接从陕西引进的秦川牛，以役用为主。上个世纪70年代，政府开始有组织的进行黄牛杂交改良，先后引进过短角牛、西门塔尔牛等国外优良品种进行杂交改良，但推广范围都有限。2000年以后，固原市推行退耕还林还草政策，并把草畜产业作为第一支柱产业，大力推广利木赞牛的杂交改良，目前已有很大的利木赞牛杂交群体。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid－binding proteins，FABPs）是一族分子质量为14kD～16kD的蛋白质，广泛存在于哺乳动物的小肠、肝、心、脑和骨骼肌等多种细胞内，并且含量丰富［1］，目前，已发现9种组织特异性的胞质FABP，其中 H－FABP（heart fatty acid－binding proteins，H－FABP）对动物脂肪代谢有重要作用，H－FABP在细胞内与脂肪酸结合，使细胞内外保持一定的脂肪酸浓度差，促进细胞摄取脂肪酸［2，3］，H－FABP基因敲除小鼠表现出对外围长链脂肪酸利用的严重缺陷。FABP家族成员还与细胞生长和增殖的调节有关，H－FABP能调节新生小鼠心肌细胞的生长和分化、它还能刺激细胞表面积的增加，从而导致心肌细胞的肥大［4］；而且，H－FABP尤其抑制小鼠正常乳房上皮细胞的生长，H－FABP还被认为是乳房肿瘤的抑制基因。种间H－FABP基因编码区有很高的同源性，这不仅表现在所编码的氨基酸上，还表现在DNA序列上［5］。所有FABP基因家族成员基因结构都是保守的，有4个外显子和3个内含子组成［6］，研究证实H－FABP基因是影响脂肪性状的主要候选基因［7］，从而对肉品质有重要影响，由于其影响脂肪代谢，并同时推测其对动物的生长发育也存在影响。

本研究利用PCR－RFLP研究了固原本地黄牛及其利木赞牛杂交群体H－FABP－HaeIII位点多态性及其与屠宰性状和肉品质性状的关系，以期为固原本地黄牛下一步的杂交改良提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

材料为随机抽取的41头固原本地黄牛和121头利木赞牛与固原本地黄牛的杂交1代牛（简称利杂牛），颈静脉采血，ACD抗凝，－80℃保存。然后在其中选取18月龄和6月龄利杂牛公牛各6头，18月龄和6月龄固原本地公牛各6头，共计24头进行6个月的育肥试验后，进行屠宰性能测定和肉品质测定。屠宰试验在宁夏六盘山泾河清真食品有限公司进行。

1.2 主要试剂

蛋白酶K、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶HaeIII等购自MBI（Fermantas）和上海生物工程有限公司。

1.3 固原本地黄牛及其利杂群体基因组DNA的提取

血样基因组DNA的提取采取酚氯仿法［8］。

1.4 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因的PCR扩增

引物序列参考文献［13］，上游序列5′－ AGCCTACCACAATCATCGAAGTGAA －3′；下游序列 5′－ CAAGTGATGTCTCTTGTCCATTCCA－3′，由上海生物工程公司合成。PCR反应体系为25μL：10×Buffer 2.5μL，MgCl2（25mmol／L）2.0 μL，dNTPs（2.5mmol／L）2.0μL、Taq DNA 聚合酶（2U／μL）0.5μL，上下游引物（10pmol／μL）各0.4μL，模板 DNA（50ng／μL）1.5μL，加三蒸水至25μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，（94℃变性30s，65℃复性45s，72℃延伸1min）34个循环，最后72℃延伸10min。

1.5 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因PCR－RFLP分析

图1 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因PCR产物电泳图

酶切反应体系：10×缓冲液R（含BSA）2μL，HaeⅢ（10U／μL）0.7μL，PCR产物10μL，补三蒸水至20μL，经瞬时离心后置于37℃恒温水浴摇床中消化过夜，消化后PCR产物用4g／L的琼脂糖凝胶电泳检测、成像。

1.6 数据分析

基因型与基因频率、适合性χ2检验均利用POPGENE软件完成。与生产数据的相关分析采用最小二乘线性模型，不同育肥阶段的方差分析模型如下：Y＝μ＋breed＋marker＋e其中：Y为个体表型的记录值；μ为群体平均值；breed为品种效应；marker为标记基因型效应；e为随机误差。

2 结果与分析

2.1 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因的PCR－RFLP分析

固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP基因PCR产物片段大小为2 075bp（图1），用 HaeIII限制性内切酶消化后表现多态性（图2，只显示部分多态片段）：AA型表现为7条带，片段大小分别为73 bp、124bp、146bp、169bp、312bp、599bp、653bp，BB型表现为8条带分别为73bp、124bp、146bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp，即在 AA型中的653bp的片段在BB型中被切为166bp和487 bp，AB型表现为9条带，分别73bp、124bp、146 bp、169bp、166bp、312bp、487bp、599bp、653bp，即在杂合子中所有片段大小的带都出现。然而仅就487bp、599bp、653bp三条带就能将牛进行分型（图2）。

2.2 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP－HaeⅢ基因座的遗传多态性分析

固原本地黄牛及其利杂群体的H－FABP基因座经HaeIII的酶切后表现多态性，且均在该位点处于Hardy－Weinberg平衡状态；等位基因A／B频率分别为0.7439／0.2561和0.7190／0.2810，利杂群体位点杂合度、多态信息含量、有效等位基因数均大于固原本地黄牛群体。

图2 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP－HaeⅢ基因座酶切电泳图

表1 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP－HaeⅢ基因座的遗传多态性指标

2.3 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP－HaeⅢ基因座不同基因型与部分屠宰性状和肉品质性状的关联分析

考虑品种效应、标记基因型效应及其它们之间的互作，在不同年龄阶段对屠宰性状和肉品质性状进行两因素方差分析，由表2可知：AB型个体的心重大于AA型个体，差异显著（P＜0.05）；而肾脂肪重、脂肪色泽评分、眼肌面积、系水力、粗脂肪含量，AB型个体均高于AA型个体，同时AB型个体的肌肉剪切力、粗蛋白含量小于AA型个体，但差异不显著（P＞0.05）。

表2 固原本地黄牛及其利杂群体H－FABP－HaeⅢ基因座基因型间最小二乘均值差异显著性检验

3 讨论

固原本地黄牛及其利杂群体的H－FABP基因座经HaeIII的酶切后表现多态性，且均在该位点处于Hardy－Weinberg平衡状态，说明在这个位点受到的选择压力不大，这可能是因为H－FABP基因与脂肪性状或肉品质性状相关，而这些性状都是不太容易测量的，所以在选种时，选择强度可能不大，目前在肉牛业越来越重视肉品质的趋势下，应该在以后的选种过程中加大选择的力度，提高群体的肉品质水平。利杂群体位点杂合度、多态信息含量、有效等位基因数均大于固原本地黄牛群体，说明用利木赞牛的杂交改良丰富了固原本地黄牛在该位点上的遗传资源，为后期的选种工作提供了更丰富的素材，同时，用利木赞牛的杂交改良提高了固原本地黄牛群体中B等位基因的基因频率。

脂肪酸结合蛋白（fatty acid－binding proteins，FABPs）在脂肪酸生成过程中具有重要的生物学功能，参与细胞内脂肪酸的运输，调整细胞内脂肪酸的浓度。它们能在心肌和脂肪细胞中沉积甘油三酯，这是增加肌内脂肪含量（intramuslar Fat，IMF）的主要方向，10%左右的IMF可产生理想的大理石花纹，从而形成优质高档牛肉［9］。据研究，牛肉大理石花纹性状与牛肉的嫩度高度相关，较高水平的大理石花纹可以提高牛肉的嫩度、多汁性和风味，减少牛肉在烹调过程中嫩度的变化。目前对H－FABP基因的研究多集中在猪上和鸡上，少数涉及牛，Gerbens等［10］利用侯选基因法的研究表明H－FABP基因的遗传变异与肌内脂肪含量存在相关，在杜洛克猪中存在MspI、HaeIII和HinfI酶三个多态性酶切位点，并初步发现H－FABP基因的纯合单倍体“aa dd HH”与高肌内脂肪含量相关，H－FABP基因被认为是影响肌内脂肪沉积的主效基因。庞卫军等（2005）报道，利用 PCR－RFLP（MspI、HaeIII和HinfI3种限制性内切酶）分子标记技术，检测了杜洛克猪、长白猪、大白猪、内江猪、荣昌猪、汉江黑猪、汉中白猪、八眉猪和野猪共计265头猪H－FABP基因5＇－上游区和第二内含子区的遗传变异，并利用最小二乘模型分析了H－FABP基因对猪肌内脂肪含量的遗传效应。结果表明，H－FABP基因可显著地提高IMF含量（P＜0.05），可以通过提高“aa－dd－HH”基因型的频率达到改善群体猪肉质的目的［11］。李文娟等（2006）利用RT－PCR和实时荧光定量PCR技术，分析了H－FABP基因与鸡肌内脂肪沉积的关系，结果表明，H－FABP基因mRNA随日龄的增长表达量显著降低，北京油鸡、白莱航鸡和AA鸡群体的H－FABP基因mRNA表达水平与IMF含量及胴体重呈现显著的负相关［12］。周国利等［13］报道，鲁西黄牛H－FABP基因中BB纯合基因型对牛肉嫩度剪切力值有较大的影响（P＜0.05），同时，对于肾脂肪重、脂肪色泽评分、眼肌面积、系水力等指标，AB型均高于AA型，在本试验研究的群体中，除心重指标AB型显著大于AA型（P＜0.05）外，基因型对肾脂肪重、脂肪色泽评分、眼肌面积、肌肉嫩度、系水力、肉品粗脂肪含量等指标均影响不显著，但都呈现AB基因型优于AA型的趋势，初步认为B等位基因与优良生产性能相关。本研究因为样本量限制，没有检测到BB型个体，应该进一步扩充样本量，使BB型数量到可统计的水平，以提高研究的准确性。

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