围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术及应用

韩之波 （中国医学科学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室 天津300020）

围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术及应用

韩之波 （中国医学科学院血液学研究所血液病医院实验血液学国家重点实验室 天津300020）

间充质干细胞（MSC）是来源于中胚层的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。系统地研究了P-MSC与骨髓MSC生物学特性和功能的异同，建立的围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术体系，为推动我国乃至国际干细胞药物的开发以及干细胞产业的发展起到积极的作用。

围产 间充质干细胞 骨髓 生物学

间充质干细胞（MSC）是来源于中胚层的、具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞。MSC能在特定条件下分化为包括神经细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、脂肪细胞在内的多组织系统的细胞。此外，MSC对造血、免疫炎症反应、血管新生等人体重要功能起重要调节作用。MSC是继造血干细胞之后又一类已经在世界范围内广泛临床试验的干细胞，是组织工程的种子细胞。MSC因具有广阔的临床应用前景，其技术产品的开发已经成为全球生物医药领域的竞争热点。

截止至2012年2月，在美国国立卫生研究院（National Institutes ofHealth，NIH）注册的关于间充质干细胞的临床研究已经超过200项。和其他干细胞相比，间充质干细胞因其具有良好的扩增能力、来源广泛、可避免伦理学问题等优势，已逐渐成为干细胞治疗的重要组成部分。中国是干细胞治疗临床研究比较发达的国家之一。国内的科研机构或医院在NIH注册了48项关于间充质干细胞的临床研究。目前美、英、法、韩、印等国家药品监督管理部门已批准了20多个干细胞制品分别进入I、II、III期临床研究。2010年5月4日美国FDA授权人骨髓间充质干细胞Prochymal作为孤儿药用于Ⅰ型糖尿病的临床治疗，韩国2011年7月1日批准了自体骨髓间充质干细胞Hearticellgram-AMI上市，用于心梗和心衰治疗。2012年1月19日韩国又批准了全球首个的异基因干细胞药物——脐带血来源间充质干细胞CartiStem上市，用于植入治疗关节软骨缺损。

然而，从何种组织、用什么技术去分离培养出高纯度、安全、有效、稳定、可规模化制备、质量可控、数量足够的MSC，这是干细胞领域的核心技术。骨髓是以前公认的MSC主要来源，但实际上骨髓中MSC的含量极少，仅占成人骨髓单个核细胞的0.002%～0.005%。近年发现脐血、脐带、胎盘、脂肪、肌肉、头皮、牙周质等多种组织中也可分离得到MSC。研究还发现，人体内MSC的数量随着年龄的增大而减少，在骨髓细胞中的含量分别是出生时为1/10 000，10岁为1/10万，30岁为1/25万，50岁为1/40万，80岁为1/200万。由于人体内MSC是供人一生中组织修复和再生所必需的，从伦理学、医学、细胞工程学的角度来看，成人体内的MSC显然不适合作为一种可以批量化生产用于常规治疗的MSC来源，新的临床适用型MSC亟待开发。

韩忠朝教授领导的科研团队近十年来一直致力于临床适用型间充质干细胞的鉴别、分离和培养扩增，研究发现人脐带、胎盘羊膜和绒毛膜、脐血和羊水等与出生相关的围产期组织富含间充质干细胞，现国际上统称为围产期间充质干细胞。围产期间充质干细胞（Perinatal mesenchymal stem cells，P-MSC）是介于胚胎干细胞和成人干细胞之间的干细胞，其增殖和分化能力比胚胎干细胞低，但明显高于成人干细胞（见图1）。同时，韩忠朝教授领导的科研团队系统地研究了P-MSC与骨髓MSC生物学特性和功能的异同，发现P-MSC与骨髓MSC有类似特性，但增殖分化能力更强，免疫原性更低，具有很好的造血支持、免疫调节以及组织修复与再生功能，其机制与P-MSC分泌众多因子和PGE2等有关。P-MSC不具致瘤性,也无明显促瘤性,对白血病生长有抑制等作用。由于胎盘脐带取材方便并富含干细胞，P-MSC的提取和应用系变废为宝且不存在伦理问题，特别易于规模化制备和产业化操作。

韩忠朝教授领导的科研团队以围产期间充质干细胞的分离、培养为主线，结合一些分析干细胞特性和基因稳定性的新技术、种子干细胞库技术、成品库技术条件、拉曼光谱散射分析技术、干细胞活性精确分析技术等，形成了完整的P-MSC库技术流程，包括供者筛选、组织（胎盘、脐带、脐带血）采集、P-MSC分离与培养鉴定、种子干细胞检测保存、终产品规模制备与检测、保存和发放使用的技术体系。

韩忠朝教授领导的科研团队组建了世界第一个围产期间充质干细胞库，为公众提供干细胞存储服务，储存量已突破10 000份。同时提供高纯度P-MSC供研究用。干细胞库工艺流程包括：①干细胞供者的筛查。②脐带胎盘的无菌采集、运输、保存，既能保证P-MSC的生物学活性，又能减少污染。③种子P-MSC库技术，P-MSC的分离、规模化制备和保存技术是P-MSC库建立的核心技术。通过对酶的种类、浓度、时间、温度进行实验，筛选出最佳组合，显著提高了细胞的分离效率。通过对冻存保护剂的配方进行优化，显著提高了细胞的活率。用气相液氮罐保存细胞，大大降低了细胞间交叉污染的可能。④P-MSC的检测，由于是新技术，国内外缺乏检测标准。为了确保干细胞的安全性、有效性和质量可控性，科研团队又建立了MSC库质量标准，其中检测参数二十几项，药典上没有的参数科研团队都一一建立方法，并完成了工作量巨大的方法验证工作。此外，在国际上首次建立拉曼散射光谱传感分析MSC的生物活力技术，测量不同状态下干细胞的特征拉曼光谱，为干细胞生物活力的分析提供了无创性快速检测技术。⑤质量管理体系：建立了一套完善的质量管理体系，对人、机、料、法、环等各个环节进行质量管理，实现对供者筛查、组织采集、运输、加工、检测鉴定、冻存、放行等全过程的严格监控，保证细胞库的正常运行。通过攻关，研究团队在国际上首次制定出《脐带间充质干细胞库公共库技术条件》、《脐带间充质干细胞库自体储存技术条件》和《脐带间充质干细胞制品技术条件》3种技术标准，获政府颁发的产品执行标准证书，通过ISO 9001国际认证。这些标准规范了干细胞的研究和产品制备，推动了我国干细胞产业标准化进程，制定的企业标准为国家行业标准的制定提供了依据。⑥一类新药——注射用脐带间充质干细胞的临床前安全性的评价，包括对体外连续传代培养的P-MSC选取不同代次进行传代稳定性的研究，以观察传代过程是否会发生细胞的突变。检测参数包括：染色体核型、癌基因、端粒酶、细胞表型、分化能力。结果表明，P-MSC经过传代后不会发生细胞恶性转化，传代过程安全稳定。同时，在注射用脐带间充质干细胞的临床前安全性评价中开展了全方面的实验，包括：急性毒性试验、长期毒性试验、全身过敏反应、溶血性试验、致瘤试验、对肿瘤生长的影响试验。

另外，韩忠朝教授领导的科研团队对注射用脐带间充质干细胞的制备工艺进行了严格的规范，对原料、中间品、成品都采取了严格的质量控制措施，制定了《注射用间充质干细胞（脐带）制造和检定规程》，规定了供者原代传代细胞库质量标准、成品质量标准。根据质量标准，筛选出供者细胞作为安全种子的来源，对每批成品进行质量检验，全部项目合格方可入库供临床使用，以此保证临床供应细胞的安全性。该质量标准已经过中检所专家审核，同时按该规程制备的样品经中检所复核检验全部合格。

采用自主创新技术形成的产品也产生了良好的经济效益，从2007年起投入市场到2011年12月底，累计收入达1.05亿万元人民币。同时，该技术体系的建立也受到国内外的广泛关注。2009年3月3日，韩忠朝应邀在法兰西国家医学科学院（Academie Nationale de Medecine）院士会议上报告了围产期间充质干细胞的临床前和临床实验性治疗的成功结果，引起该院的高度重视。会后法兰西国家医学科学院专门成立了5个院士工作小组，调查分析围产期间充质干细胞的科学优势、潜在风险和伦理法律相关问题，提出干细胞治疗的建议，并在法兰西国家医学科学院院刊上发表研究报告。随着研究的深入，法兰西国家医学科学院于2011年12月13日再次邀请韩忠朝于2012年1月在该院作一个《自体和异基因围产期干细胞的应用》的学术报告，获得院士们的高度评价。

韩忠朝教授领导的科研团队建立的围产期间充质干细胞的分离和规模制备与保存技术体系，为推动我国乃至国际干细胞药物的开发以及干细胞产业的发展起到积极的作用。截至2011年11月22日，美国NIH的临床试验网站（www.clinicaltrials.gov）已登记的P-MSC临床试验已经达58项（33项脐带MSC，22项脐血MSC，3项胎盘MSC）。自从2007年韩忠朝教授领导的科研团队组建了世界第一个围产期间充质干细胞库以来，目前国际和国内已经有多家干细胞库开展了围产期间充质干细胞的技术服务，还有多个围产期间充质干细胞相关的细胞治疗药物正在进行临床前或临床研究。国内单位在国内外学术刊物发表围产期间充质干细胞相关的临床试验结果论文有31篇，接受实验性治疗的患者近400例，涉及GVHD、自身免疫疾病、再障、心脏病、脑血管病、肝硬化、糖尿病等，结果显示出其具有良好的应用前景，为许多难治性疾病提供了新的治疗方案。■

2012-03-06