己酮可可碱对兔蛛网膜下腔出血后脑脊液中TGF-β1及蛛网膜纤维化作用的实验研究

王 永，孙军君，郭孝龙，段勇刚，常书峰，史保中

蛛网膜下腔出血(subarachniod hemorrhage, SAH)是神经科的一种常见急重症，交通性脑积水是其常见的严重并发症，致残率高，目前研究认为其与蛛网膜的纤维化导致的脑脊液吸收障碍有关[1]。应用抗纤维化药物减少SAH后蛛网膜纤维化，从而降低或预防慢性脑积水的发生，已作为一种治疗手段在实验与临床应用中得到证实。己酮可可碱(pentoxifylline, PTX)是甲基黄嘌呤的衍生物，是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂，以往多用于心脑血管病的治疗，近年来发现其还具有抗纤维化作用且日益受到重视，并在心、肾、肺、肝纤维化疾病及瘢痕组织的治疗中得到应用，但其对蛛网膜纤维化的作用目前尚未见报道。本实验通过枕大池两次注血法建立蛛网膜下腔出血模型，应用己酮可可碱干预后检测脑脊液中TGF-β1的浓度变化；21 d处死取脑，行Masson染色观察蛛网膜胶原纤维含量，初步探讨己酮可可碱对SAH后蛛网膜纤维化的影响及机制。

1 材料与方法

1.1动物及分组河南科技大学医学院动物室提供清洁级健康新西兰大白兔55只，雌雄不限，体质量2.0～2.5 kg。随机分为空白组15只、模型组20只、己酮可可碱干预组20只。

1.2试剂及仪器戊巴比妥钠(武汉博士德公司)；兔转化生长因子β1(TGF-β1)定量检测试剂盒(ELISA)[上海蓝基(启迪)生物技术有限公司]；PTX注射液(石家庄四药有限公司，规格：5 mL，0.1 g，批号：20110203)；北航CMIAS4.0/4.1多媒体彩色病理图文分析系统(河南科技大学医学院病理教研室提供)。

1.3动物模型制作采用枕大池两次注血法建立兔SHA模型。提前1 d将穿刺部位备皮，首先用戊巴比妥钠30 mg/kg经耳缘静脉将兔子麻醉，兔子取俯卧位固定于手术架上，备皮部位消毒铺巾，用自制穿刺针(0.55×20号精密输液器套于1 mL注射器内，注射器前端针头留长约15 mm)在枕骨大孔上缘沿正中矢状面于枕骨平面成45°夹角缓慢进针，待穿刺针有落空感，进针2～3 mm，缓慢抽出1 mL脑脊液后，快速取耳中动脉非抗凝血，按照1.0 mL/kg缓慢注入枕大池，注入时间1 min左右。注入完毕后，将兔置于头低位约30 min。术后24 h重复同样操作。空白组只抽取脑脊液，PTX干预组是在模型的基础上从第2天开始给予PTX 8 mg/kg，每天鞘内注射治疗，持续10 d。

1.4脑脊液测定分别在第3、7、11、16、21天时间点取脑脊液。将动物麻醉后缓慢抽取1.0 mL脑脊液(操作方法同前)，标本均立即存于-80℃冰箱保存待测。用ELISA法测定脑脊液中TGF-β1浓度，操作方法严格按照试剂盒上说明进行。

1.5动物标本制取及Masson染色模型组在制模成功后处死4只，观察蛛网膜下腔出血，其余动物在第21天全部处死取脑。戊巴比妥钠麻醉后，兔子仰卧固定于手术架上，开胸阻断胸主动脉，18G套管穿刺针穿刺左心室，剪开右心房，37℃生理盐水灌洗至流出无色液体后，4%多聚甲醛固定，小心咬除颅骨取出脑组织，放入Bouin固定液中固定72 h后，冲洗，取大脑凸面脑膜完整处脱水，透明，石蜡包埋，切片，Masson染色观察。测蛛网膜厚度及平均灰度值，进定量分析，以100×厚度/灰度值作为衡量胶原纤维含量的指标。

2 结果

2.1脑脊液中TGF-β1的浓度变化模型组和干预组脑脊液中TGF-β1的浓度在第3天和第16天出现两个高峰，但干预组较模型组显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，空白组无明显改变，见表1。

表1 各组在各个时间点所测得脑脊中TGF-β1浓度值对比 pg/L

2.2蛛网膜Masson染色病理观察结果切片染色显示：①硬脑膜、蛛网脑膜明显蓝染，硬膜尤为明显；②脑组织各层均无蓝染；③模型组的蛛网脑膜明显增厚，蛛网膜下腔发生黏连较多，Masson染色较深，④PTX干预组蛛网膜厚度介于模型组和空白组之间，蛛网膜下腔发生黏连较模型组少，Masson染色较模型组浅。经CMIAS 4.0/4.1多媒体彩色病理图文分析系统测量蛛网膜的灰度值及厚度，模型组灰度值低于空白组(P<0.05)，厚度值大于空白组(P<0.05)，胶原纤维含量大于空白组(P<0.05)；PTX干预组灰度值高于模型组(P<0.05)，厚度值小于模型组(P<0.05)，胶原纤维含量小于模型组(P<0.05)，见表2。

表2 蛛网膜纤维胶原病理图像分析结果

3 讨论

慢性脑积水是蛛网膜下腔出血后的常见慢性并发症之一，严重影响患者的生活质量，甚至导致患者死亡。其形成机制目前尚未完全明确。目前研究多认为与血液刺激、炎症介质释放导致的蛛网膜及蛛网膜下腔纤维化影响脑脊液吸收有关[2]。有研究表明蛛网膜下腔出血后，蛛网膜中HA、LN、PIIINP的含量明显增多，表明蛛网膜下腔出血后蛛网膜存在纤维增生现象，这可能是蛛网膜下腔出血后慢性脑积水形成的病理学基础[1]。Sajanti等发现蛛网膜下腔出血患者脑脊液中I型原胶原(PICP)和PIIINP明显升高[3-4]。目前临床上应用地塞米松降低蛛网膜纤维化的程度，从而减少脑积水的发生率。但该种方法效果有限，且副作用明显。

PTX分子式是C13H20N4O3，化学名为3，7-二甲基黄嘌呤，是甲基黄嘌呤的衍生物，是一种非特异性磷酸二酯酶抑制剂，能阻断cAMP转变为AMP，以往多用于心脑血管病的治疗，近年来发现其还具有抗纤维化作用，且日益受到重视，并在心、肾、肺、肝纤维化疾病及瘢痕组织的治疗中得到应用。本实验通过鞘内注射给药，研究PTX对SAH后蛛网膜纤维化的作用，结果表明，PTX干预组蛛网膜纤维化程度明显降低，脑脊液中TGF-β1浓度明显降低，提示PTX能够减轻SAH后蛛网膜纤维化，为临床预防和治疗SAH后脑积水的发生提供借鉴。

研究表明脑脊液中TGF-β1增高在SAH后蛛网膜纤维化过程中起重要作用。TGF-β1是一种纤维源性细胞因子，不存在于正常脑脊液中[5]。SAH时进入蛛网膜下腔的血小板、胶质细胞和炎症反应都可释放TGF-β1到脑脊液中。Motohashi等发现TGF-β1经一系列信号传递增加了细胞外基质蛋白质的积聚，导致蛛网膜黏连、增厚，使蛛网膜下腔、蛛网膜绒毛及其他表浅的血管间隙、神经根周围间隙纤维增生，发生闭塞，引起脑脊液回流和吸收障碍。TGF-β1还能促使软脑膜细胞增殖，具有刺激脑脊液增多的作用[6]。这与本实验中模型组脑脊液中TGF-β1明显升高，蛛网膜纤维增生程度明显的结论相符。

PTX能显著抑制TGF-β1诱导的蛛网膜细胞胶原mRNA上调，从而降低胶原纤维的合成，能逆转TGF-β1的促使各种间质产生细胞(如成纤维细胞)增殖和分泌的作用，可以起抑制肝脏、肾脏、肺脏、皮肤等多种器官纤维化及硬化的作用。而蛛网膜细胞是特化的成纤维细胞[7]，因而能够应用PTX来减少SAH后脑脊液中TGF-β1合成和释放，从而减低蛛网膜纤维化。PTX的抗纤维化作用还可能通过抑制细胞增生、抑制细胞外基质合成与分泌、抑制炎症反应、清除自由基等途径发挥作用[8]。通过对PTX抗蛛网膜纤维化发生机制的研究，将有助于理解SAH后慢性脑积水的形成原因，为防治脑积水提供新的思路和手段。

参考文献：

[1] 杨树旭，信照亮，钱聪，等．蛛网膜下腔出血后蛛网膜纤维化的研究[J]．中华创伤杂志，2008，24(7)：502-505．

[2] 李金星，朱贤立，赵甲山．动脉瘤性蛛网膜下腔出血后慢性脑积水的研究进展[J]．国外医学神经病学神经外科学分册，2004，31(2)：166-169．

[3] Sajanti J, Heikkinen E, Majamas K．Transient increase in procollagen propeptides in the CSF after subarachnoid hemorrhage[J]．Neurol，2000, 55(3):359-363．

[4] Sajanti J, Heikkinen E, Majamas K．Rapid induction of meningeal collagen synthesis in the cerebral cisternal and ventricular compartments after subarachnoid hemorrhage[J]．Acta Neurochir，2011,143(8):821-826.

[5] Tada T, Yabu K, Kobayashi S．Detection of active form of transforming growth factor-β in cerebrospinal fluid of patients with glioma[J]．Jpn J Cancer Res, 1993,84:544-548．

[6] Motohashi O，Suzuki M，Yanai N，et al．Thrombin and TGF-β promote human leptomeningeal cell proliferation in vitro[J]. Neurosci Lett, 1995,190: 105-108.

[7] 成令忠，钟翠平，蔡文琴．现代组织学[M]．上海：上海科学技术出版社，2003:456．

[8] 叶婷，刘晓城．己酮可可碱在肾脏疾病中的抗纤维化作用[J]．国外医学泌尿系统分册，2004,24(5)：655-658．