间充质干细胞免疫调节机制的研究新进展

郝 刚(综述)，孙天胜，李绍光(审校)

(1.中国人民解放军北京军区总医院骨科，北京100700;2.山西医科大学研究生学院，太原030001)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)具有多向分化潜能，最早发现于体外培养的骨髓细胞贴壁细胞群，随后在胎儿以及成人其他各组织器官中相继被发现［1］。国际细胞疗法间充质与组织干细胞委员会提出了鉴定MSC的三条基本标准［2］:标准培养环境下具有塑料黏附特性;常规表达CD105、CD73和 CD90，且不表达 CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79a、CD19以及人类白细胞抗原(histocompatibility locus antigen，HLA)-DR表面分子;在体外可进一步分化为成骨细胞、脂肪组织和软骨细胞。MSC具有分化为内胚层、中胚层和外胚层的多向分化潜力［3］，参与构造骨髓内造血生态位区［4］，在 体内、外均表现出强效的免疫调节功能，且 MSC易于采集、分离和体外扩增，具有“免疫豁免”特性，在各种免疫病的治疗中展现出了巨大的价值［5-7］。对于MSC作用机制的揭示及其在临床应用中的深入和拓展意义深远。现就各学科、各领域关于MSC免疫调节机制的研究成果予以综述。

1 MSC免疫调节的主要靶细胞

1.1 调节性T细胞 调节性T细胞是表达CD25的原始T细胞亚群，能够阻滞高炎性免疫应答反应，在机体免疫反应调节中发挥关键作用［8］。研究证实 MSC在体内［9］、体外［10］均可诱导调节性 T细胞的生成和聚集，一旦调节性T细胞被拮抗，MSC的免疫调节作用也随之消失［6］。

在混合淋巴细胞反应中，经白细胞介素(inter-leukin，IL)2激活的淋巴细胞培养物和MSC共生培养，可观察到CTLT细胞比例升高［9］。以上研究均证实了调节性T细胞在MSC免疫调节过程中起到重要作用，但是关于其分子作用机制的研究目前尚未揭示。

1.2 T淋巴细胞 既往研究在大鼠模型中发现了记忆性T细胞、初始性T细胞［6］以及T细胞T细胞［11］的增殖均可被MSC抑制。早在2002年，Di Nicola等［12］已证实MSC能够抑制混合淋巴细胞反应或植物凝集素刺激引起的T淋巴细胞的增殖，不受主要组织相容性复合物限制，且该抑制效应呈剂量依赖性。MSC可抑制T细胞功能，并不诱导其凋亡，有研究发现移除MSC后，外源性IL-2的加入可以使静息的T细胞激活，重新发挥其免疫应答效应。

MSC可将T细胞增殖阻滞在细胞周期的G0/G1。在分子水平，细胞周期蛋白D2的表达被抑制，细胞周期调控因子p27kip1(高表达导致细胞周期停滞，低表达或不表达导致细胞凋亡)表达被上调［11］。以上研究结果为解释MSC对T淋巴细胞增殖的抑制效应远大于对其活性及干扰素(interferon，IFN)γ生成的抑制效应。同时，MSC对T细胞分泌IFN-γ也具有抑制效应。Ren等［13］发现 MSC可抑制 IFN-γ的产生，同时IFN-γ也是MSC发挥免疫抑制功能所必需的诱导因子，故推测MSC启动免疫抑制之前，必须依赖初始T细胞活化产生的IFN-γ。Ren等［13］证实MSC不能影响初始T细胞的活化，且剔除IFN-γ基因大鼠的MSC不能抑制CD3抗体诱导的共培养体系中脾细胞增殖，同时 IFN-γ抗体可以完全逆转MSC的抑制作用。

关于MSC对细胞毒性T细胞抑制作用的研究相对较少，Maccario等［14］发现如果在混合淋巴细胞反应体系刚开始培养时就加入MSC，可以抑制T细胞介导的溶解反应。但在细胞溶解期加入MSC，并不能阻滞细胞溶解的发生，说明MSC可能抑制同种异体反应的传入期，并阻止细胞毒性T淋巴细胞形成，一旦细胞毒性T淋巴细胞被激活，MSC就不再发挥抑制效应，其机制还有待进一步研究。

1.3 B淋巴细胞 Glennie等［11］将抗CD40单克隆抗体和IL-4活化的大鼠B细胞与MSC共生培养，发现B细胞的增殖被抑制。Corcione等［15］在人类细胞试验中也证实了上述现象。Krampera等［16］研究发现IFN-γ存在时，MSC可以降低B细胞增殖能力，这可能与IFN-γ诱导MSC产生吲哚胺-2，3-二氧化酶(indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO)有关。Glennie 等［11］证实，MSC可以将B细胞的增殖阻滞在G0/G1期，并不诱导其凋亡，将B细胞和MSC通过渗透膜隔开阻止其直接接触，B细胞的增殖同样可被抑制，说明MSC对B淋巴细胞的抑制效应由可溶性因子介导，不依赖细胞接触。

MSC可抑制B细胞向抗体分泌细胞分化，减少免疫球蛋白抗体的生成，同时下调B细胞表面趋化因子受体的表达，如趋化因子CXCL12、CXCL13的受体 CXCR4、CXCR5 以及 CCR7［15］。Rafei等［17］揭示了关于MSC抑制浆细胞分泌Ig的一条信号通路，即来自MSC的趋化因子CLL2通过抑制信号转导、转录激活因子3和诱导PAX5蛋白的生成来抑制Ig分泌。但是，研究中发现提纯的MSC不能抑制B细胞增殖，说明一定还存在其他细胞因子参与MSC对B细胞的抑制。

1.4 自然杀伤细胞 现已证实自然杀伤(natural killer，NK)细胞经 IL-2或 IL-5活化后的增殖以及IFN-γ 的释放均可被 MSC 所抑制［16，18-19］。MSC 对NK细胞增殖的抑制作用呈现高剂量依赖性，Maccario等［14］发现只有当MSC浓度增高时(MSC和淋巴细胞1∶1混合)才能有效抑制NK细胞的增殖。

Krampera等［16］在早期研究中就发现MSC可以抑制NK细胞对靶细胞的溶解作用。Sotiropoulou等［18］证实MSC可以抑制NK细胞对HLA-Ⅰ阳性或阴性异体靶细胞的溶解作用。Spaggiari等［19］发现此抑制效应与活化性 NK受体 NKp30、NKp44和NKG2D表达急剧下调有关。研究认为MSC分泌的IDO、HLA-G5、地诺前列酮以及转化生长因子β等因子均对NK细胞增殖有抑制作用。

同时，活化的NK细胞可以攻击MSC，导致MSC裂解。MSC与NK细胞间的作用部分依赖细胞直接接触，部分是由可溶性因子(如转化生长因子β1、地诺前列酮)介导的。Spaggiari等［19］发现MSC不能被新鲜分离的NK细胞裂解杀伤，但可以被IL-15激活的NK细胞杀伤。Sotiropoulou等［18］发现 MSC在体外低表达HLA-Ⅰ类分子，所以其容易被IL-2活化的NK细胞所识别并溶解。

1.5 树突状细胞 树突状细胞(dendritic cells，DC)是体内唯一能活化静息T细胞的专职抗原递呈细胞，是启动、调控和维持免疫应答的中心环节。MSC可抑制DC的分化和成熟，抑制内吞功能，减少对IL-12的分泌，使其刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力减低。

Beyth等［20］发现人类MSC可以阻滞DC的成熟过程，减少单核细胞向DC转变，间接减弱T细胞活性。当纯化的T细胞或者T细胞与MSC在混合淋巴细胞反应体系中共生培养时，经超抗原-葡萄球菌肠毒素B刺激可生成一种不成熟的DC表型，IFN-γ分泌量减少，而以分泌大量的IL-10为主，该效应呈现剂量依赖性和接触依赖性。Aggarwal等［9］同样观察到MSC可以抑制Transwell体系中单核细胞来源的DC的功能和分化，且去除MSC后抑制效应随之消失。进一步研究发现，MSC可抑制CD1A、CD40、CD80(B7-1)、CD86(B7-2)和 HLA-DR 的表达，但 CD83表达增多。Aggarwal等［9］将 MSC 与纯化的成熟DC共培养，发现MSC可抑制DC1(诱导分化Th1)对肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)α的分泌，促进DC2(诱导分化Th2)对IL-10的分泌。

2 参与MSC免疫调节机制的可溶性因子

MSC能够分泌一系列生长因子、细胞因子、趋化因子及各种酶类，在细胞迁移及免疫调节机制中发挥作用。肝细胞生长因子、TNF-α、IL-10、转化生长因子α、转化生长因子β、地诺前列酮、IDO、一氧化氮(nitricoxide，NO)、HLA-G和胰岛素样生长因子结合蛋白等是目前已证实的参与MSC免疫调节的相关分子。但是，单独抑制上述任何一个因子都不能完全阻断MSC的免疫抑制效应，而且在不同的实验模型中上述因子发挥免疫抑制作用的大小也有差异。

2.1 IDO IDO可以催化色氨酸转化为犬尿氨酸原，进而抑制炎性细胞的增殖和功能的表达［21］。Hou等［22］证实炎性环境可以诱导MSC分泌IDO，促进色氨酸犬尿氨酸原转化，抑制T细胞增殖。MSC对NK 细胞［19］和 B细胞［17］也有类似的效应。使用色氨酸或者IDO抑制剂1-甲基色氨酸可以部分逆转上述效应。且色氨酸极可能是通过作用于犬尿氨酸原或者其下游降解产物(如甲基吡啶酸、喹啉酸)发挥逆转，其机制还有待进一步揭示。研究发现，甲基吡啶酸或者喹啉酸等代谢物均可独立发挥免疫抑制作用［23］。

2.2 地诺前列酮 Aggarwal等［9］发现由环氧合酶合成的地诺前列酮可诱导Treg增殖，而MSC可以表达环氧合酶1和环氧合酶2。纯化的T细胞和MSC共培养，环氧合酶2和地诺前列酮的生成增加。植物血凝素活化的淋巴细胞与MSC共培养时，使用前列腺素抑制剂可以拮抗MSC的免疫抑制作用，恢复淋巴细胞大部分的活性。

2.3 NO IFN-γ 和 TNF-α、IL-1α 或 IL-1β［13］均可诱导MSC高表达趋化因子和诱导型一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，iNOS)参与对T淋巴细胞的抑制［24］。

趋化因子可促使T细胞向邻近MSC迁移，同时MSC在局部介导NO生成，进而发挥T细胞抑制效应。不加入细胞因子，单独培养MSC时只产生少量的趋化因子，其T细胞抑制效应明显减弱。CXCR3和CCR5是T细胞特异性趋化因子受体，其拮抗剂可以抑制趋化作用，阻断MSC的免疫抑制效应。中和IFN-γ或同时阻断 TNF-α、IL-1α 和 IL-1β 也可抑制趋化因子的产生。T细胞和MSC共培养时将IFN-γ抗体加入脾细胞上清液中可部分恢复T细胞的增殖能力。若同时中和 IFN-γ、TNF-α、IL-1α 和 IL-1β 可完全阻断MSC对T细胞增殖的抑制作用，但是单独抑制其中之一或某两个因子只能部分恢复T细胞的增殖，说明 IFN-γ和 TNF-α、IL-1α 及 IL-1β 协同诱导MSC抑制T细胞增殖。

NOS在人和大鼠有3个基因型:iNOS、nNOS、eNOS，其中iNOS可诱导巨噬细胞分化，发挥免疫调节作用。Sato等［24］证实，利用iNOS选择性抑制剂可以完全阻断MSC的免疫抑制作用。Bingisser等［25］证实，NO通过抑制在T细胞活化及增殖中起关键作用的转化因子信号转导和转录激活因子5而发挥对T细胞的抑制作用。B细胞不能诱导MSC产生iNOS，但是T细胞诱导生成的NO同样可抑制B细胞的增殖效应。有研究者从剔除iNOS基因大鼠中分离出MSC，发现其对T细胞增殖的抑制作用大大减弱。在MSC与混合淋巴细胞共生培养时，使用NOS抑制剂(N-硝基-L-精氨酸甲酯)可以拮抗免疫抑制效应，呈剂量依赖性。证实了NO极有可能在大鼠MSC的免疫调节功能中占据了重要地位。

2.4 其他 HLA-G和胰岛素样生长因子结合蛋白是目前相关研究较少的可溶性细胞因子，不同程度地参与了MSC的免疫抑制，HLA-G是一种非经典的组织相容性复合体Ⅰ类分子，在MSC的免疫调节机制中发挥重要作用［26］。HLA-G通过膜结合及可溶性因子两种形式表达，与DC、NK细胞、T细胞表面的抑制类受体相互作用。HLA-G的两种不同形式在hMSC中均有表达。已证实HLA-G的中和抗体可部分拮抗MSC的免疫抑制作用。MSC可通过HLA-G抑制NK细胞和T细胞的活性，介导异体T细胞平衡向Th2漂移，诱导Treg的增殖［27-28］。目前对胰岛素样生长因子结合蛋白的了解甚少，相关研究显示其具有抑制淋巴细胞增殖和诱导凋亡的作用［29］。Gieseke等［30］的研究工作为了解胰岛素样生长因子结合蛋白在MSC免疫调节机制中的作用提供了重要依据。

3 结语

MSC具有多向分化潜能、低免疫原性及广泛的免疫调节特性，在组织工程学领域表现出极大的应用价值。近年来随着人MSC的分离、培养及体外扩增技术日趋成熟，MSC在共移植、预防和治疗移植物抗宿主病等临床领域得到了广泛应用。但是，关于MSC的起源、其确切的分子机制及体外操作对其生物学特性的影响等还有待于进一步探讨，这将对未来干细胞在实验室研究及临床应用提供重要的理论支持。

［1］da Silva Meirelles L，Chagastelles PC，Nardi NB.Mesenchymal stem cells reside in virtually all post-natal organs and tissues［J］.Cell Sci，2006，119(Pt 11):2204-2213.

［2］Dominici M，Le Blanc K，Mueller I，et al.Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The International Society for Cellular Therapy position statement［J］.Cytotherapy，2006，8(4):315-317.

［3］Sato Y，Araki H，Kato J，et al.Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion［J］.Blood，2005，106(2):756-763.

［4］Dazzi F，Ramasamy R，Glennie S，et al.The role of mesenchymal stem cells in haemopoiesis［J］.Blood Rev，2006，20(3):161-171.

［5］Uccelli A，Moretta L，Pistoia V.Immunoregulatory function of mesenchymal stem cells［J］.Eur J Immunol，2006，36(10):2566-2573.

［6］Gonzalez-Rey E，Gonzalez MA，Varela N，et al.Human adipose-derived mesenchymal stem cells reduce inflammatory and T cell responses and induce regulatory T cells in vitro in rheumatoid arthritis［J］.Ann Rheum Dis，2010，69(1):241-248.

［7］Le Blanc K，Rasmusson I，Sundberg B，et al.Treatment of severe acute graft-versus-host disease with third party haploidentical mesenchymal stem cells［J］.Lancet，2004，363(9419):1439-1441.

［8］Burchell JT，Strickland DH，Stumbles PA.The role of dendritic cells and regulatory T cells in the regulation of allergic asthma［J］.Pharmacol Ther，2010，125(1):1-10.

［9］Aggarwal S，Pittenger MF.Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses［J］.Blood，2005，105(4):1815-1822.

［10］Augello A，Tasso R，Negrini SM，et al.Cell therapy using allogeneic bone marrow mesenchymal stem cells prevents tissue damage in collagen-induced arthritis［J］.Arthritis Rheum，2007，56(4):1175-1186.

［11］Glennie S，Soeiro I，Dyson PJ，et al.Bone marrow mesenchymal stem cells induce division arrest anergy of activated T cells［J］.Blood，2005，105(7):2821-2827.

［12］Di Nicola M，Carlo Stella C，Magni M，et al.Human bone marrow stromal cells suppress T-lymphocyte proliferation induced by cellular or nonspecific mitogenic stimuli［J］.Blood，2002，99(10):3838-3843.

［13］Ren G，Zhang L，Zhao X，et al.Mesenchymal stem cell-mediated immunosuppression occurs via concerted action of chemokines and nitric oxide［J］.Cell Stem Cell，2008，2(2):141-150.

［14］Maccario R，Podestà M，Moretta A，et al.Interaction of human mesenchymal stem cells with cells involved in alloantigen-specific immune response favors the differentiation ofT-cell subsets expressing a regulatory/suppressive phenotype［J］.Haematologica，2005，90(4):516-525.

［15］Corcione A，Benvenuto F，Ferretti E，et al.Human mesenchymal stem cells modulate B-cell functions［J］.Blood，2006，107(1):367-372.

［16］Krampera M，Cosmi L，Angeli R，et al.Role for interferon-gamma in the immunomodulatory activity of human bone marrow mesenchymal stem cells［J］.Stem Cells，2006，24(2):386-398.

［17］Rafei M，Hsieh J，Fortier S，et al.Mesenchymal stromal cell-derived CCL2 suppresses plasma cell immunoglobulin production via STAT3 inactivation and PAX5 induction［J］.Blood，2008，112(13):4991-4998.

［18］Sotiropoulou PA，Perez SA，Gritzapis AD，et al.Interactions between human mesenchymal stem cells and natural killer cells［J］.Stem Cells，2006，24(1):74-85.

［19］Spaggiari GM，Capobianco A，Abdelrazik H，et al.Mesenchymal stem cells inhibit natural killer cell proliferation，cytotoxicity and cytokine production:role of indoleamine 2，3-dioxygenase and prostaglandin E2［J］.Blood，2008，111(3):1327-1333.

［20］Beyth S，Borovsky Z，Mevorach D，et al.Human mesenchymal stem cells alter antigen-presenting cell maturation and induce T-cell unresponsiveness［J］.Blood，2005，105(5):2214-2219.

［21］Sørensen RB，Hadrup SR，Svane IM，et al.Indoleamine 2，3-dioxygenase specific，cytotoxic T cells as immune regulators［J］.Blood，2011，117(7):2200-2210.

［22］Hou F，Huang JM，Zhang R，et al.An experimental study on the regulation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells through indoleamine 2，3-dioxygenase signaling pathway by thymosin α1 for improving the immunosuppression mediated by T cell［J］.Zhonghua Er Ke Za Zhi，2011，49(3):181-185.

［23］Frumento G，Rotondo R，Tonetti M，et al.Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2，3-dioxygenase［J］.Exp Med，2002，196(4):459-468.

［24］Sato K，Ozaki K，Oh I，et al.Nitric oxide plays a critical role in suppression of T-cell proliferation by mesenchymal stem cells［J］.Blood，2007，109(1):228-234.

［25］Bingisser RM，Tilbrook PA，Holt PG，et al.Macrophage-derived nitric oxide regulates T cell activation via reversible disruption of the Jak3/STAT5 signaling pathway［J］.J Immunol，1998，160(12):5729-5734.

［26］Nasef A，Mathieu N，Chapel A，et al.Immunosuppressive effects of mesenchymal stem cells:involvement of HLA-G［J］.Transplantation，2007，84(2):231-237.

［27］Selmani Z，Naji A，Zidi I，et al.HLA-G5 secretion by human mesenchymal stem cells is required to suppress T-lymphocyte and NK function and to induceregulatory T cells［J］.Stem Cells，2008，26(1):212-215.

［28］Carosella ED，Moreau P，Le Maoult J，et al.HLA-G molecules:From maternal-fetal tolerance to tissue acceptance［J］.Adv Immunol，2003，81:199-252.

［29］Spoerri PE，Caballero S，Wilson SH，et al.Expression of IGFBP-3 by human retinal endothelial cell cultures:IGFBP-3 involvement in growth inhibition and apoptosis［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2003，44(1):365-369.

［30］Gieseke F，Schütt B，Viebahn S，et al.Human multipotent mesenchymal stromal cells inhibit proliferation of PBMCs independently of IFNgammaR1 signaling and IDO expression［J］.Blood，2007，110(6):2197-2200.