Toll样受体在角膜上的表达及在单疱病毒角膜炎中的作用

程 芳(综述)，席兴华(审校)

(深圳市人民医院，暨南大学第二临床学院眼科，广东深圳518020)

20世纪80年代就有研究人员已经在果蝇身上发现了 Toll受体(Toll like receptor，TLR)，但直到1996年才发现了人类Toll样受体，这为解释微生物感染的机制提供了很好的依据。目前在人类的树突状细胞、单核细胞、上皮细胞和血管内皮细胞中相继发现了TLR1～TLR11共11个成员。TLR特异性地识别病原相关分子结构，并经过髓样分化因子88(myeloid differentiaion factor 88，MyD88)依赖途径或MyD88非依赖途径被激活可引起一系列复杂的信号转导，诱导炎性介质产生。目前，有关TLR在眼部的研究领域已经涉及角膜、虹膜、睫状体和视网膜。近年来研究发现TLR在角膜炎的发生、发展和治疗中具有极其重要的作用。

1 TLR的结构、功能

TLR是一类高度保守的糖蛋白模式识别受体，能识别细菌、病毒、真菌和原生动物上病原菌相关分子模式的保守基因序列。它是一种跨膜蛋白，由细胞外区、跨膜区和细胞质区三个部分组成。细胞外区是一个富含亮氨酸的重复序列，参与病原微生物的识别。细胞外区在识别病原体相关信号结构后，释放信号并经过TLR跨膜结构转导进入细胞内，由胞内区的TLR域吸引并激活各自的调节器，启动下游信号转导。胞质区与白细胞介素(interleukin，IL)1受体家族的信号区高度同源，称Toll/IL-1受体区，是TLR下游信号转导通路的起点，Toll/IL-1受体吸引并结合下游信号链相应的调节器分子(如MyD88)，使其活化向下游转导，引起细胞因子、趋化因子和黏附因子表达，从而引起机体免疫应答。这种经过 MyD88转导的信号途径称为MyD88依赖途径，除了 TLR3，其余所有TLR信号都要经过这一途径。另一种称为MyD88非依赖途径，主要由调节蛋白Toll/IL-1受体调节干扰素 β 等基因转录［1］。

TLR在上皮细胞、内皮细胞、抗原递呈细胞、淋巴细胞等均有表达。至今在人类细胞中已发现10种功能性TLR［2］，均位于细胞膜表面。其中TLR2常与TLR1或TLR6结合成二聚体，识别各种细菌脂蛋白;TLR2/6和TLR2/1聚合体分别识别细菌二酰和三酰脂多肽;TLR2也可作为一种同型二聚体识别其他配体，如革兰阳性细胞壁、脂磷壁酸、酵母多糖和热休克蛋白等［3］。MD-2是由纤维母细胞等产生的，其在脂多糖-TLR4转导过程中起着重要作用。TLR4也可与CD14形成复合物识别革兰阴性菌的脂多糖［4］。TLR5可识别细菌鞭毛蛋白。TLR10可与TLR1或 TLR2形成二聚体。TLR3、7、8、9位于细胞内核膜上。TLR3可识别病毒复制的副产物双链RNA。TLR7、8则可以识别病毒单链RNA。TLR9能对细菌和病毒DNA未甲基化的胞嘧啶-磷酸-鸟苷二核苷酸作出应答。

TLR除了可识别病原菌相关分子模式外，还可识别许多生物性配体，如组织细胞破裂释放的细胞内成分核酸、热休克蛋白、细胞外基质分解物透明质酸碎片、纤维蛋白原等［5］。因此，TLR还具有监视并修复组织损伤的功能。TLR若被自身配体激活也可能引起疾病的发生，如在人类和鼠的系统性红斑狼疮疾病中TLR9可以被自身生物体DNA激活，这说明其在自身免疫性疾病的发生、发展过程中起着重要作用［6］。TLR对病原微生物以及自身坏死细胞释放物质的识别均能引起一系列炎性反应，这就需要对这两者进行鉴别。

2 TLR在角膜上的表达

有研究报道角膜上皮细胞表达TLR4，随后很多研究相继报道了TLR1～10 mRNA均可表达于角膜上皮，但存在不均衡性，其中TLR7、8的表达较少。角膜表面TLR在角膜表层的分布及功能研究目前尚未达成共识［7］。Ueta等［8］发现人角膜上皮细胞(human corneal epithelial cell，HCEC)上的 TLR2 对肽聚糖没有反应。而Kumar等［9］认为细胞表面TLR2可激活核因子κB，引起细胞因子和抗微生物缩氨酸(人类 β-防御素 2)表达。同样 Kumar等［10］通过HCEC的研究观察到功能性的TLR3可以在上皮细胞内表达。但是，也有人认为上皮细胞内的TLR4对脂多糖刺激不产生应答，这就可以提供一个免疫静止环境从而避免对共生体产生不必要的应答［9］。

以上研究结果是通过细胞培养得到的，不同的结果和研究可能与提供的原始细胞、培养环境及细胞传代不同有着很大联系。Blais等［11］发现单独脂多糖对IL-6和IL-8的分泌几乎起不到什么影响，如果加上CD14或脂多糖结合蛋白就可以增加它们的分泌，这表明培养环境在细胞对脂多糖反应中起到关键性的作用，甚至缺乏MD-2也可导致HCEC对脂多糖反应失败［4］。

Blais等［11］在人类角膜组织切片中发现TLR4和MD-2的表达位于基底部而不是表面上皮细胞，还有其他研究人员报道TLR5也具有相同的分布特征，这表明只有在上皮细胞出现缺损时TLR4和TLR5才能被激活，从而可以避免一些不必要的免疫应答产生。有趣的是，Hozono等［12］指出，可以激活 HCEC上的基因转录和细胞因子的产生的物质是一种鞭毛蛋白，它来自角膜致病菌而不是来自角膜非病原菌或肠道致病菌，但其机制尚不十分清楚。

目前大多数的研究认为，角膜上皮细胞表达TLR。但有人发现，培养的纤维母细胞也可以表达TLR1、3、4、6、7、9，甚至也能表达功能性的 TLR3 和TLR4，当这些受体被活化后即可刺激细胞因子的分泌。这一过程主要发生在角膜上皮缺损时，所以在角膜上皮不完整、有病原菌感染时，上述受体就可被激活而引起免疫应答。

有研究利用免疫组织化学方法检测到TLR2、4、9在结膜上皮和基质中表达，TLR9表达更多。有些通过印迹细胞学收集样品并培养细胞的研究表明，结膜上皮细胞可以固定地表达TLR1～6、9，较少表达TLR7，但不表达 TLR8、10。活化的 TLR1、2、3、4 和 5可以刺激结膜上皮细胞因子的分泌［13］。但是，Talreja等［14］认为因为结膜上皮细胞缺乏MD-2，所以TLR4及脂多糖不能刺激细胞因子分泌。

总之，现在很多关于TLR的研究证实角膜及结膜均能表达多种TLR，它们能够对外来入侵的病原菌作出免疫应答从而减少感染，但是TLR的激活很可能弊大于利，因为它可以引起大量炎性反应，从而损害组织。

3 TLR在单纯疱疹病毒中的作用

单纯疱疹病毒(herpes simplex virus，HSV)主要是由HSV-Ⅰ感染导致的疾病，可引起角膜炎症和角膜瘢痕形成，是主要的致盲性眼病之一。单纯疱疹病毒性角膜炎(herpes simplex keratitis，HSK)容易反复发作、迁延不愈，并对抗病毒药物也表现出耐药性。通常在角膜上皮组织完整的情况下可以抵抗病原菌的入侵，但是一旦角膜上皮和角膜基质在感染HSV后可通过TLR启动了机体免疫应答而引起一系列炎性反应。尽管机体炎性反应可限制病毒侵害的范围，但是也对角膜上皮造成了一定损害，从而导致角膜瘢痕形成及视力下降。尤其是与那些野生种类的小鼠作比较，缺乏TLR2或TLR4，甚至较低程度的TLR9都可以使HSV感染对角膜的损害大大降低［15］。适配分子 MyD88是除了 TLR3外其他 TLR信号转导的必需物质，对于那些缺乏MyD88的小鼠可以抵抗损害的发展，但是不能控制HSV感染甚至死于HSV等引起的脑炎［15］。这些发现表明，TLR在HSV感染的过程中既可以减少病毒侵害的范围，也可能诱发炎性反应而危及患者视力。Jin等［16］指出，在感染HSV的人类角膜上几乎所有TLR都有表达，尤其 TLR4、7、8、9 mRNA 及 TLR2和 TLR9蛋白的表达与正常人角膜相比显著增高。

TLR3在对抗病毒感染中起着重要作用，主要是通过对病毒dsRNA作出应答并产生IL-6、IL-8和 干扰素β等，从而引起炎性反应。Ueta等［17］最近报道结膜上皮细胞上的TLR3不仅能诱导抗病毒免疫应答，而且还能够抑制变态反应。TLR7和TLR8可以识别病毒单链RNA(ssRNA)激活组织产生干扰素α。HCEC的HSV-Ⅰ感染可以诱导TLR7的产生及IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α的分泌，从而在HSK免疫应答中起着重要作用［18］。另外与健康人相比较，当患者感染 HSV 后角膜中 TLR4、7、8、9 表达升高［16］。Wuest等［19］指出在小鼠角膜HSV-Ⅰ感染中TLR9对早期趋化因子的增加起着重要作用。

角膜上皮细胞感染HSV-Ⅰ后可以出现核因子κB和有丝分裂原活化蛋白激酶活化的两个峰值［20］。在感染初期(感染后1～4 h)IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子α、干扰素β表达升高，随后(感染后8 h)TLR7表达升高，TLR3表达下降，这表明TLR在整个感染过程中一直在起着重要作用。Cook等［21］也指出，由HSV引起的持久的TLR活化可能引起某些细胞因子的长期表达，这对于感染后病理学研究具有更重要的意义。

以上结果均表明，TLR 3、4、7、9参与了 HSK 时角膜上皮细胞对HSV的免疫应答反应，角膜上皮细胞TLR的活化导致了抗病毒分子的产生，从而可以直接保护角膜表面免受更大范围的侵害。通过应用咪喹莫特(一种TLR7兴奋剂)来治疗人类乳突状瘤病毒感染，证明了TLR对于控制病毒感染的重要性，同样该药在临床上治疗HSK也取得了一定疗效［22］。用TLR3激动剂多胞嘧啶核苷酸(poly I:C)对小鼠进行预处理后可以诱导脑内早期多种免疫基因应答，从而减少感染HSV-Ⅰ脑膜炎的病毒量并延长其存活率至94%［23］。尽管许多TLR的激活有显著的治疗效果，但是也可导致角膜表面的炎性刺激，从而影响视力。有研究表明，TLR2、TLR9被特殊配体激活后可引起角膜中性粒细胞增多聚集，从而使得角膜水肿透明度减低。Zhou等［24］认为TLR2抑制剂复合物E567能够抑制人类及小鼠培养细胞的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒及HSV-Ⅰ的复制，从而控制疾病的复发。

TLR兴奋剂已经在临床上被尝试用于治理过敏、感染、炎症性疾病取得一定疗效［25］，临床上常用的5%咪喹莫特乳剂通过调节TLR7、TLR8活性诱导体内包括干扰素α在内的细胞因子而产生抗病毒活性，局部用于治疗成人外生殖器和肛门的疣/尖锐湿疣，现在部分医师用于治疗皮肤癌、基底细胞癌等。所以，TLR也有可能成为角膜炎症治疗中的新靶点。目前常用于角膜抗炎治疗的药物有非甾体类、类固醇、环孢素，其中皮质激素通过影响TLR表达和信号转导而广泛用于角膜表面炎症性疾病。Jin等［26］指出氢化可的松可以增加TLR2和TLR4在HCEC的表达，并减少在人类角膜纤维母细胞中的表达，所以在减轻炎症的同时又能增加感染的机会。因此，应用TLR治疗病毒感染性疾病尚有许多问题需要解决。

4 结语

TLR是角膜上皮细胞膜表面表达的重要的生物学分子之一，其具有监测各种病原菌并启动固有免疫系统产生免疫应答的作用，但其在诱导免疫反应的同时又可诱导炎性反应的产生，可加重角膜表面损伤。根据其作用机制等研发的一些新的抗炎药物在角膜炎的治疗中具有一定作用，但其潜在的不良反应仍需引起足够的重视。越来越多的以TLR为靶点的研究将为角膜表面炎症的治疗开辟新的途径。

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