骨关节炎滑膜纤溶酶原激活物抑制因子的表达及意义

李茂强 朱六龙 边振宇 季 成 陆 凯

骨关节炎的发病机制非常复杂，往往由多种因素引起。研究表明尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase－type plasminogen activator，uPA)及其受体可能与骨关节炎软骨降解有关，而组织型纤溶酶原激活物(tissue plasminogen actor，tPA)可能只参与局部纤溶平衡［1］。纤溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor，PAI)对 uPA、tPA 有明显的抑制作用，但PAI在骨关节炎发生发展中的作用尚不明确，我们对滑膜中的两种PAI进行检测，结合相关文献，探讨其在骨关节炎的发病机制中的作用。

材料与方法

1．材料:选取2008年1月～2010年1月在笔者医院行关节镜清理术的40例骨关节炎患者，其中男性11例，女性29例，年龄37～74(59．6±6．40)岁;所有患者均经临床及关节镜确诊，符合Altman诊断标准。10例膝关节创伤后行关节镜诊治术的患者做为对照组，既往无骨关节炎病史，关节镜下无骨关节炎表现，其中男性8例，女性2例，年龄36～64(50．7±9.87)岁。两组患者均于关节镜术中用髓核钳取关节滑膜3～5片，每片约2mm×3mm×1mm。

2．试剂和仪器:①一抗兔抗人 PAI－1、PAI－2、uPA、tPA多克隆抗体均购自武汉博士德公司，SP免疫组化试剂盒和DAB显色剂购自福州迈新公司;②主要仪器:关节镜(Stryker 597T型)、石蜡切片机 (Leica2135型)、恒温干燥箱(HG303型)、显微镜(OlympusCX31RBSF型)、微波炉(NNK 653S型)。

3．方法:所有组织标本一经取下立即用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，5μm连续切片，分别行HE染色和PAI－1、PAI－2、uPA、tPA蛋白SP法免疫组化染色。结果判断:①结合HE染色切片，根据苏木素复染后的细胞形态，鉴别滑膜中的不同细胞类型;②用乳腺癌作阳性对照，PBS代替一抗作阴性对照。细胞质和(或)细胞膜上出现明显的棕色或棕黄色颗粒为阳性;③参照Szekanecz等［2］方法，根据10×40倍高倍镜视野下滑膜组织中的阳性细胞占全部细胞(包括滑膜衬里细胞、滑膜下层单核细胞、巨噬细胞及血管内皮细胞)的比例计算百分比，阳性细胞数占总细胞数＞20%为阳性，对标本取5个不同视野计数，取其平均值。

4．统计学方法:χ2检验相关性分析，以p＜0．05为差异有统计学意义。

结 果

1．PAI－1在关节滑膜中的表达:PAI－1阳性表达反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒。40例骨关节炎滑膜中，PAI－1蛋白表达阳性26例，阳性表达率65%;10例对照滑膜中，PAI－1阳性1例(10%)。两组比较差异有统计学意义(p＜0．05)，阳性细胞主要分布在滑膜衬里细胞，亦可见于滑膜下层单核细胞和血管内皮细胞(图1A)。

2．PAI－2在关节滑膜中的表达:PAI－2阳性表达反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒。40例骨关节炎滑膜中，PAI－2蛋白阳性25例，阳性表达率62．5%。10例对照滑膜中，PAI－2阳性 1例(10%)，并且着色较淡。两组比较差异有统计学意义(p＜0．05)，阳性细胞主要分布在滑膜衬里细胞(图1B)。

3．uPA在关节滑膜中的表达:uPA阳性表达反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒(图1C)。40例骨关节炎滑膜中，uPA蛋白阳性31例，阳性表达率77．5%。

4．tPA在关节滑膜中的表达:tPA阳性表达反应定位于细胞质，呈黄色或棕黄色颗粒(图1D)。40例骨关节炎滑膜中，tPA蛋白阳性37例，阳性表达率92．5%。

图1 骨关节炎滑膜免疫组织化学染色(SP法，×400)

5．PAI－1与uPA蛋白表达:阳性细胞百分比呈直线正相关(r=0．630，P ＜0．01);PAI－1 与 tPA 蛋白表达阳性细胞百分比呈直线正相关(r=0．417，p＜0.01);PAI－2与uPA、tPA蛋白表达阳性细胞百分比无直线相关关系。

讨 论

丝氨酸蛋白酶通过多种方式促进细胞外基质和基膜的降解，参与纤溶、炎症、细胞迁移等多种生理病理过程，uPA、tPA均属于丝氨酸蛋白酶。在骨关节炎中，uPA对软骨的降解在骨关节炎的发生发展中具有重要作用，而PAI是uPA、tPA的天然抑制因子，我们通过免疫组化的方法，观察PAI在骨关节炎滑膜中的表达，探讨其在骨关节炎发生发展中的作用。

PAI－1和PAI－2是正常血浆中纤溶酶原激活物(plasminogen activator，PA)的主要抑制因子，以PAI－1更为重要。PAI－1是由379个氨基酸组成的糖蛋白，分子质量约50kDa，能快速与uPA、tPA结合，抑制其活性，是人体纤溶系统的主要调节因子。关节滑膜成纤维细胞、内皮细胞、软骨细胞等均能合成PAI－1和PAI－2，主要作用是维持局部PA/PAI系统的平衡［3］。IL－1、IL －6、TNF － α、粒细胞 － 巨噬细胞集落因子(GM－CSF)可在局部影响 PAI产生［4］。

研究表明，骨关节炎滑膜中uPA的表达与软骨降解的程度密切相关，而PAI作为uPA的抑制因子，与软骨降解之间的关系还未完全阐明［5］。本研究观察到骨关节炎滑膜衬里层细胞可见PAI－1和PAI－2阳性表达，滑膜下层细胞、血管内皮细胞及单核－吞噬细胞亦出现阳性表达。虽然对照滑膜也检测到其阳性表达，但强度较弱，并且阳性率与骨关节炎滑膜差异有显著统计学意义。提示PAI和骨性关节炎关系密切，可能在骨关节炎发生发展中具有重要作用。

通过相关性分析，PAI－1与uPA、tPA蛋白表达阳性细胞百分比呈直线正相关;PAI－2与uPA、tPA蛋白表达阳性细胞百分比无直线相关关系。提示PAI，尤其是PAI－1在骨关节炎滑膜中维持PA/PAI平衡具有重要作用。PAI的增加是与PA系统相互作用的结果，骨关节炎滑膜中PA/PAI系统失去平衡后，PA增高，通过机体的反馈，导致PAI的增高，以适应局部的PA增高，在高水平达到新的平衡。PAI也对uPA有重要调节作用，与uPA和uPAR结合成复合物，通过细胞内吞作用，使uPA在溶酶体中降解，uPAR再次循环至细胞表面表达，通过此途径可调节uPA的分泌和uPAR的表达。PAI和PA的相互作用，使PA/PAI处于一种动态平衡，致使组织降解不至于过于剧烈，骨关节炎的软骨降解表现为长期慢性的过程可能与此有关。

研究表明，PAI具有许多独立于PA的功能，如对血管生成的调节等。PAI在骨关节炎中表达的调控，亦可能有其独立的激活机制，参与骨关节炎的形成及发展。

1 Matucci－ cerinic M，Lombardi A，Lotti T，et al．Fibrinolytic activity in the synovial membrane of osteoarthritis［J］．Br J Rheumatol，2005，29(4):253－294

2 Szekaneca Z，Haines GK，Koch AE．Differential expression of the urokinase receptor(CD87)in arthritic and normal synovial tissues［J］．J Clin Pathol，1997，50:314 －319

3 Cevinie MM，Generini S，Partsch G，et al．Synoviocytes from osteoarthritis and rheumatoid arthritis profuce plasminogen activators and plasminogen activator inhibitor－1 and display u－PA receptors on their surface［J］．Life Sci，2008，63:441 －453

4 Mandl－Weber S，Haslinger B，Lederer SR，et al．Heat－ killed microorganisms induce PAI－1 expression in human peritoneal mesothelial cells:role of interleukin － 1alpha［J］．Am J Kidney Dis，2001，37(4):815－819

5 李茂强，李宽新，史晨辉，等．骨关节炎滑膜的uPA表达与关节软骨破坏程度的相关研究［J］．中国内镜杂志，2006，12(24):29－31