骨髓瘤细胞诱导破骨前体细胞分化的分子机制探讨

汤丽苑 俞 康

多发性骨髓瘤(MM)是以骨髓微环境中浆细胞恶性增殖为特征的血液肿瘤．RANKL/核因子－κB受体活化因子(receptor activator of NF－κB，RANK)/护骨素(osteoprotegerin，OPG)与MM发病关系密切［1］。但目前国内外对 MM细胞本身是否表达RANKL仍未达成共识。本文着重研究人骨髓瘤细胞株RPMI8226能否表达 RANKL。通过 rhRANKL、条件培养液与RANKL mAb体外干预，从细胞水平和基因水平探讨骨髓瘤细胞RPMI8226诱导RAW264．7细胞分化成熟的影响，从而进一步阐明骨髓瘤骨病(myeloma bone disease，MBD)的分子机制。

材料与方法

1．主要材料:鼠单核吞噬细胞株(RAW264．7)购于北京协和医科大学细胞库。人骨髓瘤细胞株(RPMI8226)和人成骨肉瘤细胞株(MG－63)购于武汉大学细胞保藏中心。人抑制性RANKL单克隆抗体MAB6262，MAB6261(用于Western blotting)和rhRANKL购于R＆D公司。TRAP染色试剂盒购于Sigma公司。高糖DMEM培养基购买至GIBCO公司。Random Primer、反转录酶、Rnaisn、dNTP mix、5 × reaction buffer购于Fermentas公司。PCR引物由上海生工生物工程公司合成。Platinum PCR Supermix购于Invitrogen公司。

2．工作液的配制:MAB6262、MAB6261干粉500μg用 1ml无菌PBS溶解，配成浓度为500μg/ml，分装后 －80℃储存。rhRANKL蛋白干粉10μg用0．2ml无菌PBS溶解，配成浓度为50μg/ml，加入0．1%人白蛋白保持其活性，分装后－80℃储存。

3．细胞培养:RAW264．7、RPMI8226 与 MG －63 细胞用10%FCS－DMEM培养基培养，培养条件为37℃，5%CO2，2～4天换液传代。盼蓝拒染试验检测活细胞率均在95%以上。

4．条件培养液收集:当RPMI8226和MG－63细胞株处于对数生长期时，以1×105/ml密度传代接至25cm2细胞培养瓶内，培养2天后将细胞悬液或上清液移至离心管中，离心力200g，离心5min后，取上清液，离心力500～600g，离心10min完全去除细胞后，收集条件培养液，－80℃冻存备用。

5．TRAP染色:根据试剂盒使用说明书的步骤进行。RAW264．7细胞以1．5×104/孔接种于6孔板，培养过夜后更换不同条件培养液(100ng/ml rhRANKL、30%MG－63细胞条件培养液、30%RPMI8226细胞条件培养液以及 1μg/ml RANKLmAb干预组)，第7天TRAP染色，细胞用4%多聚甲醛固定10min后，加染色液，37℃避光水浴90min后，双蒸水洗3次，干燥后用中性树脂封固，光镜下计数(放大100倍)各组每孔中TRAP阳性多核破骨细胞(≥3个核)的数量，并摄片记录。

6．RT－PCR 检测:每106～107RPMI8226、MG －63细胞或每孔加入1．0ml Trizol混匀，以一步法抽提总RNA，紫外分光光度法检测RNA浓度和纯度，各组OD260/OD280比值(＞1.8)。反转录体系含 RNA 1μg，dNTP 2．0μl，M －Mulv 反转录酶 1μl，引物 1μl，以 DEPC 水补充至 20μl，42℃，60min，70℃，10min完成反转录反应。RT－PCR反应体系为15μl。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，扫描条带后用Quantity One软件分析测定各扩增带A值(吸光度)。用目的条带吸光度与内参(β－actin)条带吸光度之比表示组织目的基因mRNA的含量，重复实验3次。各反应条件如表1。

7．Western blotting法检测:RPMI8226和MG－63细胞取对数生长期时传代，以1×105/ml密度接种于25cm2的培养瓶中，培养3天后分别通过离心或细胞刮刀获取细胞，提取总蛋白。将20μl蛋白经12%十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰胺凝胶(SDS－PAGE)电泳分离后，转移至PVDF膜，于摇床上封闭1．5h，分别加入鼠抗人RANKL单克隆抗体(MAB6261)和兔抗人β－actin单克隆抗体，4℃过夜，TBST充分漂洗。加入辣根过氧化物酶连接的羊抗鼠IgG室温轻摇1．5h，同上漂洗，与ECL化学发光试剂反应，常规方法显色、定影。

结 果

1．RANKL和mRANKL裂解酶(TACE、ADAM19)mRNA表达:本试验以能表达RANKL的MG－63细胞为阳性对照［10］，发现 RPMI8226细胞能表达RANKL mRNA(255bp)和两种RANKL裂解酶:TACE mRNA(440bp)和 ADAM19 mRNA(625bp)，而MMP14两种细胞均未检测到(图1、图2)。

2．Western blotting法检测RANKL表达:本试验证实 RPMI8226细胞表达 mRANKL(跨膜型)和sRANKL(可溶型)蛋白(图3)。

图3 Western blotting法检测RPMI8226细胞表达RANKL蛋白

3．TRAP染色观察 RAW264．7细胞形态:TRAP染色观察不同实验组中RAW264．7细胞培养7天的变化。无诱导的RAW264．7细胞胞体较小，椭圆形，或梭形，大部分细胞呈TRAP阴性单核细胞，少数为TRAP阳性的单核或多核细胞。加条件培养液或重组RANKL蛋白的RAW264．7细胞中出现成熟破骨细胞明显增多，胞体较大，形态不规则，呈油煎蛋形或漏斗形等，几个到几十个不等的细胞核(≥3个)，核圆形，大小较一致，互相拥挤或重叠，细胞边缘见伪足样突起，胞质呈空泡状，胞质TRAP酶活性部位呈玫瑰红色，细胞核为阴性，即为TRAP阳性多核成熟破骨细胞(图4)。

图4 RAW264．7细胞株TRAP染色形态图A．空白组(×100);B．100ng/ml rhRANKL组(×100);C．30%RPMI8226条件培养液组(×100);D．30%MG－63条件培养液组(×100)

4．TRAP阳性的多核破骨细胞计数:(1)100ng/ml rhRANKL、30%RPMI8226细胞与30%MG－63细胞条件培养液对RAW264．7细胞的诱导分化作用:此3组培养液诱导的TRAP阳性多核破骨细胞数和空白组比较有显著差别(p＜0．01)。100ng/ml rhRANKL诱导分化作用比其他两诱导组明显(p＜0.01)(表 2)。(2)1μg/ml RANKL mAb抑制 RPMI8226细胞条件培养液与rhRANKL的诱导分化作用:1μg/ml RANKL mAb抑制30%RPMI8226条件培养液或100ng/ml rhRANKL诱导的TRAP阳性多核破骨细胞数明显低于不加抗体的诱导组，p＜0．01。1μg/ml RANKL mAb阻断30%RPMI8226条件培养液组与空白组无差别;而1μg/ml RANKL mAb阻断100ng/mL rhRANKL组相比空白组有统计学意义，p＜0．05(表 3)。

表2 rhRANKL、RPMI8226与MG－63细胞条件培养液诱导RAW264．7细胞分化为TRAP阳性多核破骨细胞

表3 1μg/ml RANKL mAb抑制RPMI8226细胞株条件培养液与rhRANKL的诱导分化作用

5．破骨细胞表型基因TRAPmRNA表达:加30%MG－63细胞条件培养液、30%RPMI8226细胞条件培养液或 100ng/ml rhRANKL的 RAW264．7细胞TRAP基因表达量明显高于空白组，p＜0．01。30%RPMI8226细胞条件培养液组比30%RPMI8226细胞株条件培养液+1μg/ml RANKL mAb组TRAP表达量高，P ＜0．05(表4与图5)。

表4 各试验组TRAP mRNA表达

图5 各试验组诱导RAW264．7细胞株表型基因TRAP的表达

讨 论

RANKL/RANK/OPG系统在MBD的破骨细胞分化和功能调节中起举足轻重的作用。但目前国内外对骨髓瘤细胞本身是否表达RANKL仍未存在争议。

Sezer等［2］利用流式细胞术，免疫细胞化学染色和免疫印迹法发现6种人MM细胞株如RPMI8226，U266等和6例MBD患者的MM细胞都表达RANKL。Heider等［3］以流式细胞仪分析正常浆细胞发现胞膜上RANKL不表达或弱表达，但伴骨质破坏患者的MM细胞胞膜RANKL表达显著高于正常人和无骨质破坏患者，差异有统计学意义。Croucher等［4］用 RT－PCR和流式细胞术证明了纯化的5T2MM鼠骨髓瘤细胞中RANKL mRNA和蛋白的表达。Farrugia等［5］用流式细胞术和RT－PCR法分析高度纯化的人MM细胞表达RANKL蛋白和mRNA。

然而仍有许多专家持反对意见，认为MM细胞不自主分泌RANKL，而是诱导骨髓微环境中其他细胞分泌RANKL，促进破骨细胞与MM细胞的生长、存活和分化。Giuliani等［6］利用免疫印迹法和RT－PCR发现10种人MM细胞株如U266等，和26例MM患者的MM细胞均不表达 RANKL，仅产生极少量的OPG。在细胞共同培养中，人MM细胞促进人骨髓前成骨细胞或基质细胞上调RANKL mRNA和蛋白的表达，明显下调OPG生成，这一作用依赖于细胞间的直接接触。同样，Pearse等［7］检测5种骨髓瘤细胞株也未发现RANKL蛋白和mRNA的表达。

基于上述研究，本试验着眼于MM细胞自身是否表达RANKL以及其功能展开深入研究。MBD研究迄今为止，已有多种分离MM细胞的方法，但常混杂其他细胞，所以选取经典的人MM细胞株RPMI8226作为研究对象。我们采用免疫印迹法证明了RPMI8226细胞能表达 mRANKL蛋白(46/48kDa)和sRANKL 蛋白(24/26kDa)，这与 Sezer等［2］的研究结果相同。而且 RPMI8226细胞表达的 mRANKL和sRANKL分子质量大小与Lacey等［8］的研究结果相一致。RANKL在体内有mRANKL和sRANKL两种形式，sRANKL分为原发分泌型和蛋白酶裂解膜蛋白型。目前已知的RANKL裂解酶主要有3种:肿瘤坏死因子α转化酶(TACE)，解聚素－基质金属蛋白酶19(ADAM19)和Ⅰ型膜型基质金属蛋白酶(MMP14)［9，10］。本试验结果发现 RPMI8226 细胞表达2种RANKL裂解酶TACE和ADAM19 mRNA。证明了RPMI8226细胞通过自主分泌或RANKL裂解酶TACE、ADAM19酶解作用产生sRANKL。研究表明不论mRANKL，还是sRANKL均有共同的羧基末端活性受体结合域，因此都能与相同的受体结合，发挥诱导破骨细胞分化成熟的生物学作用，并且可与 OPG结合，失去生物学活性。

本研究发现RPMI8226细胞、MG－63细胞条件培养液与rhRANKL(编码mRANKL胞外段136－317位氨基酸，与 sRANKL序列相似)均能明显诱导RAW264．7细胞分化为TRAP阳性的多核破骨细胞。说明RPMI8226细胞条件培养液中存在能诱导RAW264．7细胞分化成熟的物质。这与Lai等报道的人骨髓瘤细胞株NCI－H929，U266的条件培养液能诱导人骨髓单个核细胞分化为TRAP阳性的多核破骨细胞一致。同时1μg/ml人抑制性RANKL单克隆抗体能显著阻断30%RPMI8226细胞条件培养液与100ng/ml rhRANKL诱导的RAW264．7细胞株分化成熟作用，间接证明了RPMI8226细胞条件培养液中起诱导作用的重要成分为sRANKL。

同时本试验通过RT－PCR显示rhRANKL、MG－63细胞与 RPMI8226细胞条件培养液能诱导RAW264．7 细胞上调 TRAP mRNA。1μg/ml人抑制性RANKL单克隆抗体能抑制30%RPMI8226细胞条件培养液的诱导分化作用使TRAP mRNA表达与空白组相近，并与TRAP染色实验的结果一致。1μg/ml人抑制性 RANKL单克隆抗体阻断100ng/ml rhRANKL诱导的TRAP mRNA表达高于空白组，和TRAP染色实验的结果一致，这可能与100ng/ml rhRANKL未被单克隆抗体完全中和有关。

目前我们证实了骨髓瘤RPMI8226细胞能表达RANKL，且其细胞培养液所含 sRANKL具有促使RAW264．7细胞分化为成熟破骨细胞的生物活性。这一发现将为探索骨髓瘤骨病的分子机制以及寻找治疗新靶点，提供实验和理论基础。

1 Roodman GD．Pathogenesis of myeloma bone disease［J］．Leukemia，2009，23(3):435 －441

2 Sezer O，Heider U，Zavrski I，et al．Immunocytochemistry reveals RANKL expression of myeloma cells［J］．Blood，2002，99(12):4646－4647

3 Giuliani N，Bataille R，Mancini C，et al．Myeloma cells induce imbalance in the osteoprotegerin/osteoprotegerin ligand system in the human bone marrow environment［J］．Blood，2001，98(13):3527 －3533

4 Croucher P I，Shipman CM，Lippitt J，et al．Osteoprotegerin inhibits the development of osteolytic bone disease in multiple myeloma［J］．Blood，2001，98(13):3534－3540

5 Farrugia AN，Atkins GJ，To LB，et al．Receptor activator of nuclear factor－ κB ligand expression by human myeloma cells mediates osteoclast formation in vitro and correlates with bone destruction in vivo［J］．Cancer Res，2003，63(17):5438 － 5445

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7 Pearse RN，Sordillo EM，Yaccoby S，et al．Multiple myeloma disrupts the TRANCE/osteoprotegerin cytokine axis to trigger bone destruction and promote tumor progression［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2001，98(20):11581 －11586

8 D．L．Lacey，E．Timms，H．L．Tan，et al．Osteoprotegerin Ligand Is a Cytokine that Regulates Osteoclast Differentiation and Activation［J］．Cell，1998(93):165 － 176

9 Chesneau V，Becherer JD，Zheng Y，et al．Catalytic propertiesof ADAM19［J］．J Biol Chem，2003，278(25):22331 －22340

10 Atsuhiko Hikita，Ikuo Yana，Hidetoshi Wakeyama，et al．Negative Regulation of Osteoclastogenesis by Ectodomain Shedding of Receptor Activator of NF － κB Ligand［J］．The Journal of Biological Chemistry，2006，281(48):36846 －36855