高效液相色谱法测定镇江香醋中5-羟甲基糠醛的含量

张玉玉， 宋 弋， 周婷婷， 吕 茜， 杨瑞学， 李全宏

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083;2.中国农业机械化科学研究院，北京 100083)

高效液相色谱法测定镇江香醋中5-羟甲基糠醛的含量

张玉玉1， 宋 弋1， 周婷婷1， 吕 茜1， 杨瑞学2， 李全宏1

(1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京 100083;2.中国农业机械化科学研究院，北京 100083)

采用高效液相色谱法，对镇江香醋中5－羟甲基糠醛进行了定量分析.样品中的HMF含量的测定条件为:以甲醇－水溶液(体积比为5∶95)为流动相，流速为1.0 mL/min，采用Venusil XBPC18色谱柱分离，柱温为30℃，UV检测器的检测波长为284 nm.定量分析结果表明，镇江香醋中HMF的含量为8.01 mg/kg.高效液相色谱法分析镇江香醋中HMF含量的方法测定准确，稳定性高，HMF 在0.014 3 ～0.085 8 μg的进样范围内线性相关系数为 R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相对标准偏差为5.53%.

镇江香醋;高效液相色谱;5－羟甲基糠醛;含量检测

酿造食醋在我国有两千多年的历史［1］，是我国的传统调味品，在饮食和保健方面都具有广泛的应用.镇江香醋作为酿造食醋的一种，具有“色、香、醇、酸、浓”的特点，为我国传统名醋之一［2］，其香醋酿造技艺被列入首批“国家级非物质文化遗产名录”［3］.国标GB/T 18623—2002对镇江香醋的定义是，以优质糯米为原料，采用传统的复式糖化、酒精发酵和醋酸固态分层发酵工艺，经陈酿酿制而成的香气浓郁、酸而不涩的食醋［4］.镇江香醋的香气成分［5－7］和营养保健作用已经得到了广泛的研究，其具有降血压、降血脂、消除疲劳、抗菌、防治感冒、抗氧化等作用［8－9］.

5－羟 甲 基 糠 醛 (5－hydroxymethylfurfural，5－(hydroxymethyl)furan－2－carbaldehyde，HMF)，是葡萄糖或果糖等单糖化合物在高温或酸性条件下，催化脱水产生的一种醛类化合物，是美拉德反应的重要中间产物［10］.5－羟甲基糠醛广泛存在于酒类［11］、酱油［12］、蜂蜜［13］、烘焙食品［14］、醋［15］以及一些药物中［16－17］.研究表明，一定剂量的糠醛或 HMF被机体吸收后，可引起动物横纹肌麻痹和内脏损害，并对眼黏膜、上呼吸道黏膜等产生刺激作用［18］.5－羟甲基糠醛含量的测定方法主要有高效液相色谱法［19］、气相色谱质谱法［20］、紫外比色法［21］.目前，利用高效液相色谱法，测定镇江香醋中5－羟甲基糠醛含量的研究还未见报道.

本文采用高效液相色谱法，对镇江香醋中的5－羟甲基糠醛进行定量分析，旨在建立一种准确测定镇江香醋中5－羟甲基糠醛含量的方法，为镇江香醋的生产提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

镇江香醋，购于北京的超市.

5－羟甲基糠醛，纯度99%，Sigma公司;甲醇，色谱纯，北京爱希姆科技发展有限公司;水为超纯水;0.45 μm水系滤膜，蓝弋化工产品有限责任公司.

1.2 仪器与设备

LC－20A型高效液相色谱仪(配有LC－20AT型洗脱泵、SPD－20A型检测器、CTO－20A型柱温箱、LC Solution工作站)，岛津国际贸易有限公司;Venusil XBP－C18色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm)，博纳艾杰尔科技有限公司;LGJ－12型冷冻干燥机，北京松源华兴科技公司;2000D型超纯水器，北京长风仪器仪表公司.

1.3 方法

1.3.1 标准品溶液的配制

精确称取HMF标准品0.028 6 g，用超纯水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得0.286 mg/mL的HMF标准品储备液，于4℃条件下避光保存.

1.3.2 样品溶液的配制

准确称取醋样品71.710 0 g，－45℃冷冻干燥24 h，得5.280 7 g干燥醋样品.取干燥醋样品0.301 1 g，用超纯水溶解并定容至 50 mL，0.45 μm 的水系微孔滤膜过滤后得测样液，待HPLC分析.

1.3.3 分析测定条件

色谱条件为Venusil XBP－C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);柱温为30℃;UV检测器检测波长为284 nm;流动相为5%甲醇，95%水(体积百分含量);流速为 1.0 mL/min;进样量为 20 μL.

2 结果与分析

2.1 色谱条件优化

通过优化流动相的比例，当流动相组分为甲醇－水(5∶95，V/V)，等梯度洗脱，流动相流速 1.0 mL/min，检测波长284 nm时，HMF标准溶液的色谱峰图形较好，见图1.

图1 HMF标准溶液液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of HMF standard solution

2.2 标准曲线和线性范围

取0.286 mg/mL的HMF标准品储备液1 mL，用超纯水溶解，定容到100 mL的容量瓶中，得2.86 μg/mL标准品溶液.取HMF标准品溶液(2.86 μg/mL)5，10，15，20，30 μL，注入液相色谱仪，依次经优化的高效液相色谱条件进行分析.以进样量为横坐标，以对应色谱峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，见图2，得到线性回归方程:y=7 ×106x－704.57，R2=0.999 9.结果表明，进样量在 5 ～30 μL(0.014 3 ～0.085 8 μg)的范围内，呈良好的线性关系.

图2 5－羟甲基糠醛标准曲线Fig.2 Standard curve of 5－hydroxymethylfurfural

2.3 重复性实验

取测样液，相同体积20 μL，进样5次，分别按上述色谱条件测定其中HMF的含量，计算所测含量的相对标准偏差(RSD)为5.40%(见表1)，说明本方法用于测定镇江香醋中5－HMF含量具有较好的重复性.

表1 重复性实验结果Tab.1 Result of repeatability test

2.4 稳定性实验

取2.86 μg/mL的标准品溶液，室温放置.每1.5 h进样1次，测定5次，分别进样20 μL.结果表明，所测含量的相对标准偏差(RSD)为2.83%(见表2)，说明处理后的标准溶液在室温条件下6 h内稳定.

表2 稳定性实验结果Tab.2 Result of stability test

2.5 精密度实验

在室温条件下，取同一质量浓度的HMF标准品溶液(2.86 μg/mL)，连续 5 次进样，每次 20 μL，结果见表3.

表3 精密度实验结果Tab.3 Result of precision test

表3结果表明，同样浓度的标准品溶液连续进样的相对标准偏差为0.27%，说明该方法的精密度较高.

2.6 加样回收试验

取已知含量的样品约5 mL，共9份，分别加入浓度为 2.86 μg/mL HMF 的标准品溶液 0.8，1.0，1.2 mL.经测定、计算得 HMF平均回收率为98.7%，RSD 为5.5%，结果见表 4.

表4 HMF加样回收率试验结果Tab.4 HMF recovery tests and corresponding relative standard deviations

Theobald等［15］采用高效液相色谱法，对未经过前处理的醋样品中HMF的含量进行了测定，其回收率范围在95%～101%.

2.7 样品测定

将镇江香醋样品，按1.3.2的既定实验条件制备样品溶液，用高效液相色谱测定HMF峰面积，液相色谱图如图3.

将测定的HMF峰面积代入回归方程，计算镇江香醋样品中HMF的含量，为8.01 mg/kg.镇江香醋中HMF含量的计算公式见式1.

式(1)中，y为峰面积，V1为稀释体积，mL;V2为进样体积，mL;m1为冷冻干燥后的质量，g;m2为稀释时取样的质量，g;m3为冻干前样品的质量，g;m为样品中HMF的含量，mg/kg.Theobald等［15］分析了欧洲的7种醋中HMF的含量，发现醋样品中的HMF含量从10 mg/L至3.3 g/L不等，认为焦糖化不是HMF的唯一生成途径，HMF的含量可能与醋的储藏时间有关.镇江香醋样品中HMF的含量为8.01 mg/kg，比Theobald等测定的欧洲7种醋样品低.镇江香醋的主要原料为优质糯米，在复式糖化、酒精发酵、醋酸固态分层发酵和陈酿的过程中，也会发生焦糖化和糖的脱水降解等反应，产生HMF.

图3 镇江香醋样品中HMF的定量检测液相色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of HMF determination in Zhenjiang vinegar

3 结论

运用高效液相色谱法检测镇江香醋中的HMF含量，选定的检测条件为:流动相为甲醇－水溶液(体积比为 5∶95)，流速为 1.0 mL/min，分离色谱柱为Venusil XBP－C18，柱温30℃，UV检测器的检测波长为284 nm.镇江香醋中含有较多的低沸点挥发性成分，运用冷冻干燥法处理样品，可以除去部分干扰HMF测定的成分，使得HMF含量的液相色谱定量测定方法准确度、精密度均较好，重现性良好，在0.014 3 ～0.085 8 μg的进样范围内线性相关系数为R2=0.999 9，平均回收率98.66%，相对标准偏差为5.53%.定量分析结果表明，镇江香醋中HMF的含量为8.01 mg/kg.镇江香醋中HMF含量的测定结果表明，与欧洲的醋样品相比，镇江香醋中的HMF含量相对较低.

［1］赵谋明.调味品［M］.北京:化学工业出版社，2001:88－89.

［2］曹雁平.食品调味技术［M］.北京:化学工业出版社，2002:141－148.

［3］余永建，张叔萍，赵顺华，等.利用红曲菌及植物乳酸杆菌生产功能性镇江香醋工艺的研究［J］.中国调味品，2010(12):68－70.

［4］中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局.GB/T 18623—2002镇江香醋［S］.北京:中国标准出版社，2003.

［5］孙宗保，赵杰文，邹小波，等.镇江香醋特征香气成分加工过程中的变化和形成机理分析［J］.中国食品学报，2010，10(3):120－127.

［6］孙宗保，赵杰文，邹小波，等.镇江香醋加工过程中理化指标分析及其与香气成分关系初探［J］.食品科学，2009，30(9):59－61.

［7］孙宗保，邹小波，赵杰文.几种中国传统名醋挥发性风味成分的比较研究［J］.中国调味品，2010，35(9):34－41.

［8］徐清萍，陶文沂，敖宗华.镇江香醋抗氧化活性成分来源分析［J］.食品与发酵工业，2005，31(3):33－36.

［9］沈志远.镇江香醋的营养保健和药用功能研究［J］.食品科学，2005，26(8):483－485.

［10］Hodge J E.Dehydrated Foods:Chemistry of browning reactions in model systems［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1953，1(15):928－943.

［11］Chen L，Huang H，Liu W，et al.Kinetics of the 5－hydroxymenthylfurfural formation reaction in Chinese rice wine［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2010，58(6):3507－3511.

［12］王妙飞，张水华，郭新东，等.高效液相色谱法测定酱油中的5－羟甲基糠醛［J］.现代食品科技，2008，24(2):188－190.

［13］Ajlouni S，Sujirapinyokul P.Hydroxymenthylfurfuraldehyde and amylase contents in Australian honey［J］.Food Chemistry，2010，119(3):1000－1005.

［14］Akpınar K，Karakaş B，Akça H，et al.Determination of HMF in roasted flour/oil mixtures and effect of solvent used in the extraction procedure ［J］.Food Chemistry，2011，128(3):790－794.

［15］Theobald A，Müller A，Anklam E.Determination of 5－hydroxymethylfurfural in vinegar samples by HPLC［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，1998，46(5):1850－1854.

［16］马长海.奥扎格雷钠葡萄糖注射液中5－羟甲基糠醛的 RP－HPLC 测定 ［J］.中国医药指南，2009，7(14):21－22.

［17］王兰，徐春明.反相色谱法测定葡萄糖注射液中5－羟甲基糠醛的含量［J］.中国医疗前沿，2009，4(13):113－114.

［18］谭俊杰，柴建国，张善飞，等.参麦注射液中5－羟甲基糠醛含量的高效液相色谱测定［J］.时珍国医国药，2010，21(7):1624－1625.

［19］Spano N，Casula L，Panzanelli A，et al.An RP－HPLC determination of 5－hydroxymethylfurfural in honey:The case of strawberry tree honey［J］.Talanta，2006，68(4):1390－1395.

［20］Gaspar E M，Lopes J F.Simple gas chromatographic method for furfural analysis［J］.Journal of Chromatography A，2009，1216(14):2762－2767.

［21］张翠，柴欣生，罗小林，等.紫外光谱法快速测定生物质提取液中的糠醛和羟甲基糠醛［J］.光谱学与光谱分析，2010，30(1):247－250.

(责任编辑:李 宁)

Determination of 5-hydroxymethylfurfural in Zhenjiang Vinegar by HPLC

ZHANG Yu－yu1， SONG Yi1， ZHOU Ting－ting1， LÜ Qian1， YANG Rui－xue2， LI Quan－hong1
(1.College of Food Science and Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China;2.Chinese Academy of Agricultural Mechanization Science，Beijing 100083，China)

A method for determination of 5－hydroxymethylfurfural by high－performance liquid chromatography in Zhenjiang vinegar was developed.Samples were analyzed on a Venusil XBP－C18 column with oven temperature of 30℃，using a mixture of methanol and water(5∶95，v/v)as the mobile phase with the flow rate of 1.0 mL/min，and detected at 284 nm.Within the linear range of 0.014 3 ～0.085 8 μg，the correlation coefficient was 0.999 9.The method was accurate with the average recoveries rate and relative standard deviation of 98.66%and 5.53%，respectively.

Zhenjiang vinegar;high－performance liquid chromatographic;5－hydroxymethylfurfural;content determination

TS264.2

A

1671－1513(2012)02－0039－04

2011－07－11

国家“十二五”科技支撑计划项目(2011BAD23B01).

张玉玉，女，博士研究生，研究方向为天然产物化学;

李全宏，男，教授，博士，博士生导师，主要从事天然产物化学及农产品综合利用方面的研究.通讯作者.