姜辣素对顺铂致大鼠异嗜模型行为的作用

王茂龙，杨玉玲，魏朝霞，岳 旺，徐万群

(青岛大学医学院附属医院1.胸外科、2.感染科，山东 青 岛 266003;3.青岛大学医学院药理学教研室，山东青岛 266021;4.青岛大学医学院附属医院急诊内科，山东 青 岛 266003)

呕吐是机体的保护性反射，可由多种因素诱发，肿瘤化疗是最常见的原因之一，高致吐性化疗药顺铂是良好的动物模型致吐剂。人类呕吐化学感受器触发区(chemoreceptor trigger zone，CTZ)位于延髓背面极后区(the area postrema，AP)内，与迷走神经背核邻近，顺铂刺激后5-HT、P物质等经血液循环至AP区可以刺激CTZ引起呕吐。大鼠虽无呕吐反射，但延髓亦具有AP区，其作用与CTZ相似，使用顺铂后，5-HT、P物质等化学物质作用于CTA，可以产生条件味觉厌恶(conditioned taste aversion，CTA)反应，使大鼠产生异嗜高岭土的行为，其异嗜高岭土的程度可间接反映呕吐的程度［1］。

生姜作为传统中药已有一千多年的历史，有“止呕圣药”之美誉，姜辣素(gingerol)是生姜提取物之一，其主要成分有［2］-、［4］-、［6］-姜酚和姜烯酚［2－3］等，止吐效果已得到广泛研究。地塞米松有良好的止吐作用，可联合5-HT3受体阻滞剂及NK1受体阻滞剂应用［4］，但其具体作用机制尚不清楚。

本研究观察姜辣素抑制顺铂所致的大鼠异嗜高岭土行为，并观察大鼠AP区神经元和回肠末端神经节c-fos蛋白的表达。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 姜辣素(宝鸡宏远生物制药，批号2005071223)溶于质量分数为1%的西黄耆胶;顺铂(齐鲁制药，批号903005CE)溶于50℃温生理盐水;盐酸昂丹斯琼注射液(奥赛康制药，批号090102);阿瑞吡坦(Chemvon生物制药，批号CV2910A006095)溶于质量分数为1%的西黄耆胶;磷酸地塞米松钠注射液(鲁抗制药，批号090717302);兔抗c-fos试剂盒(北京博奥森生物bs0469R)。

1.2 动物试验 健康♂成年Wistar大鼠［华中科技大学实验动物中心，SCXK(鄂)2004-0007］36只，体质量200～250 g，室温(22±2)℃，单笼饲养，12 h明暗周期(18:00～6:00为暗周期)。随机分成6组:空白组、模型组、昂丹司琼+地塞米松组、阿瑞吡坦+地塞米松组、姜辣素组及姜辣素+地塞米松组。顺铂(3 mg·kg－1)腹腔注射(ip)造模，并于顺铂注射前1 h及注射后24 h、48 h各组分别给予以下处理:生理盐水(10 mg·kg－1，ig)、西黄芪胶(10 ml·kg－1，ig)、昂丹司琼(4 mg·kg－1，ip)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、阿瑞吡坦(8 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip)、姜辣素(400 mg·kg－1ig)、姜辣素(400 mg·kg－1，ig)+ 地塞米松(5 mg·kg－1，ip);观察顺铂注射后0～24 h、48 ～72 h各组大鼠摄食量和啃食高岭土量。72 h后处死大鼠，取AP区及回肠末端(距回盲瓣约20 cm)组织于4%的甲醛4℃固定。

1.3 免疫组化和图像分析 将组织石蜡包埋，切片，严格按照抗c-fos免疫组化试剂盒说明操作。常规漂洗，抗体封闭，加1∶200稀释的兔c-fos多克隆抗体，漂洗后加生物素化二抗，显色，复染，脱水，透明，中性树胶封片。200倍光镜下随机选取5个视野并照相，观察外周回肠及AP区组织阳性产物的染色情况。黄光源下为浅黄色背景，标记阳性颗粒在细胞质表达，呈棕黄色或棕褐色。用奥林巴斯图像分析系统计算阳性细胞灰度值(0代表强阳性，255代表阴性)。

2 结果

2.1 嗜高岭土量 分别记录0～24 h、48～72 h各组大鼠啃食高岭土量。两个时间段内，模型组啃食高岭土量明显高于正常组(P＜0.01)。0～24 h，各治疗组啃食高岭土量低于模型组(P＜0.05)。姜辣素组及姜辣素+地塞米松组啃食高岭土量与昂丹斯琼+地塞米松组相比差异无显著性。48～72 h，阿瑞吡坦+地塞米松组、姜辣素组、姜辣素+地塞米松组与模型组相比均减少(P＜0.05)。姜辣素组、姜辣素+地塞米松组啃食高岭土量低于阿瑞吡坦+地塞米松组(P＜0.05)，两个时间段内，姜辣素组与姜辣素+地塞米松组啃食高岭土量差异无显著性。

2.2 摄食量 分别记录0～24 h、48～72 h各组大鼠摄食量。两个时间段内，模型组与正常组相比摄食量减少(P＜0.01)。0～24 h，姜辣素组进食量高于昂丹司琼+地塞米松组和模型组(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松组进食量高于模型组(P＜0.05)，与昂丹司琼+地塞米松组比较无差异;姜辣素组进食量高于姜辣素+地塞米松组(P＜0.05)。48～72 h，姜辣素组摄食量高于模型组和阿瑞吡坦+地塞米松组(P＜0.05)。姜辣素+地塞米松组与模型组比较差异无显著性。

Tab 1 The kaolin and food ingestion and c-fos immunoexpression of rats in every group

2.3 c-fos表达 c-fos阳性颗粒在回肠末端组织表达于肌间神经节(Fig 1)，在AP区表达于神经元(Fig 2)。模型组阳性颗粒灰度值低于正常组(P＜0.01)。与模型组相比，其余4组阳性颗粒灰度值均增加(P＜0.05)。昂丹司琼+地塞米松组、姜辣素组灰度值均低于阿瑞吡坦+地塞米松组(P＜0.05)，姜辣素+地塞米松组灰度值与阿瑞吡坦+地塞米松组比较差异无显著性。姜辣素组灰度值低于姜辣素+地塞米松组(P＜0.05)。

Fig 1 Immunoexpression for c-fos in the ileum of rats in every group(HE×200)

3 讨论

化疗诱发的恶心呕吐反应(chemotherapy-induced nausea and vomiting，CINV)按发生时间不同可分为预期性、急性和迟发性三大类［5］。急性恶心呕吐(acute CINV)发生于化疗开始后24 h内，即本实验的第0～24 h期。研究表明，神经递质5-HT及其受体-3在急性CINV期起主要作用［7］，临床常用选择性5-HT3受体拮抗剂(昂丹斯琼等)对急性期CINV有良好治疗作用［8］。本实验选用昂丹斯琼联合地塞米松作为阳性药物对照，比较了姜辣素及其联用地塞米松在急性CINV期的抗呕吐效果。迟发性CINV一般发生于化疗后24～48 h后，有时可持续长达1周，相当于本实验的48～72 h时期。上世纪90年代开始发现神经激肽P物质及其受体NK1在迟发CINV中具有重要作用［9］，本实验选用选择性NK1受体拮抗剂阿瑞吡坦联合地塞米松作为另一阳性药物对照，比较姜辣素及其联用地塞米松在迟发性CINV期的抗呕吐效果。

A:The immunoexpression for c-fos in the AP of the blank control group was light;B:The immunoexpression for c-fos was significant in model group;C:The change of immunoexpression for c-fos in Ondansetron+D group was significant compared with blank control group;D:The change of immunoexpression for c-fos in aprepitant+D group was not significant compared with blank control group;E:The changes of immunoexpression for c-fos in gingerol and gingerol+D groups were similar compared with aprepitan+D group and blank control group.

多项动物实验结果表明生姜可抑制顺铂所致恶心呕吐［10－11］，亦有临床研究证实生姜可有效改善顺铂化疗患者的恶心呕吐情况［12］。生姜抗呕吐作用主要有效成分为姜辣素，是［6］-、［8］-、［10］-姜酚(gingerol)和［6］-、［8］-、［10］-姜烯酚(shogaol)等的混合物［2－3］，其作用机制最初认为是可阻断 5-HT3受体［13］，后证实其抑制5-HT3受体的功能并非与5-HT3受体竞争性结合，而是作用于一个调节性位点，此位点可调节P物质受体和胆碱能受体表达［14］，也有研究证实姜辣素可作用于辣椒素受体(VR1)［15］，因此，姜辣素通过作用于多种受体发挥抗呕吐作用。本研究显示在0～24 h内，姜辣素、姜辣素+地塞米松组啃食高岭土量与昂丹斯琼+地塞米松组相比差异无显著性，即无论是否联用地塞米松，姜辣素与昂丹斯琼联用地塞米松抗呕吐效果相当，先前实验亦证明姜辣素可通过下调5-HT表达抑制急性期CINV［16］。阿瑞吡坦+地塞米松组啃食高岭土量多于昂丹斯琼+姜辣素组，因阿瑞吡坦为选择性NK1受体拮抗剂，对主要由5-HT引起的急性期CINV作用较弱，故美国临床肿瘤学会(ASCO)肿瘤化疗抗呕吐指南中指出，阿瑞吡坦需与5-HT3受体拮抗剂联合应用以增强其抗呕吐效果［4］。姜辣素联用地塞米松与单用姜辣素相比食高岭土量差异无显著性，说明地塞米松对姜辣素治疗急性呕吐无辅助作用。在48～72 h内，姜辣素组、姜辣素+地塞米松组与阿瑞吡坦+地塞米松组相比食高岭土量减少，即姜辣素抗呕吐效果优于阿瑞吡坦+地塞米松，其原因可能是阿瑞吡坦是单一NK1受体拮抗剂，而姜辣素可通过作用于多种介质及受体联合发挥抗呕吐作用［8］。姜辣素组与姜辣素+地塞米松组食高岭土量差异无统计学意义，提示地塞米松对姜辣素治疗迟发性呕吐也无辅助作用。

生姜被证实可逆转顺铂引起的胃排空障碍［17］，增加胃动力［18］，促进食欲［19］。本研究中姜辣素组大鼠进食量较模型组增加，说明姜辣素作为生姜的有效止吐成分，可促进大鼠进食。也有学者认为生姜对胃动力的促进作用是其止吐机制之一［20］。姜辣素+地塞米松组24 h内比模型组摄食量增加，但48～72 h期间，该组大鼠摄食量与模型组差异无显著性，其原因尚不清楚。

c-fos存在于中枢和外周神经系统，中枢神经细胞受刺激后，引起 c-fos、c-jun转录，翻译成 fos、jun等磷蛋白，形成同源或异源二聚体激活蛋白-1(AP-1)，调节靶基因编码，进而导致CNS形态、结构和功能长时程的改变［21］。研究发现，给哺乳动物注射催吐药物后可引起脑内 c-fos蛋白表达增加［22－23］，给予5-HT3受体拮抗剂预处理可使急性期c-fos表达减少［24］，说明c-fos表达可以从组织学角度反映呕吐行为的严重程度。本实验通过测定延迟期c-fos的表达，进一步证实姜辣素在延迟期抑制大鼠异嗜行为的效果。顺铂注射后大鼠AP区神经元及回肠末端肌间神经节c-fos表达均增加。治疗组c-fos表达较模型组均减少，其中阿瑞吡坦+地塞米松组、姜辣素组、姜辣素+地塞米松组c-fos表达均少于昂丹斯琼+地塞米松组，说明阿瑞吡坦及姜辣素抑制延迟性呕吐的作用强于昂丹斯琼。姜辣素联用地塞米松后c-fos表达少于单用姜辣素组，此结果与两组大鼠食高岭土量结果有差异，原因尚需进一步研究。

综上所述，姜辣素是从天然食用品生姜中提取的有效成分，毒副作用小，无须与地塞米松联合应用，即对类似于人类呕吐的大鼠异嗜模型急性期及延迟期均有抑制作用，并可以促进大鼠摄食，有利于改善营养状况，是一种具有临床实用价值的新型止吐药物。

［1］Takeda N，Hasegawa S，Morita M，et al.Pica in rats is analogous to emesis:an animal model in emesis research［J］.Pharmacol Biochem Behav，1993，45(4):817－21.

［2］Kawai T，Kinoshita K，Koyama K，et al.Anti-emetic principles of Magnolia obavata bark and Zingiber officinale rhizome［J］.Planta Med，1994，60:17－20.

［3］Yang Y，Kinoshita K，Koyama K，et al.Structure-antiemetic activity of some diarylheptanoids and their analogues［J］.Phytomedicine，2002，9:146－52.

［4］Kris M G，Hesketh P J，Somerfield M R，et al.American society of clinical oncology guideline for antiemetics in oncology:Update 2006［J］.J Clin Oncol，2006，24(18):2932－47.

［5］Licitra L，Spinazzw S，Roila F.Antiemetic therapy［J］.Crit Rev Oncol Hematol，2002，43(1):93－101.

［6］赵忠斌，魏振平，芮 伟.化疗止吐临床治疗药物新进展［J］.

世界临床药物，2006，27(8):480－4.

［6］Zhao Z B，Wei Z P，Rui W.The research of clinical anti-emetic medicines［J］.World Clin Drugs，2006，27(8):480－4.

［7］Endo T，Minami M，Hirafuji M，et al.Neurochemistry and neuropharmacology of emesis-the role of serotonin［J］.Toxicology，2000，153:189－201.

［8］Kris M G，Hesketh P J，Herrstedt J，et al.Consensus proposals for the prevention of acute and delayed vomiting and nausea following high-emetic-risk chemotherapy［J］.Support Care Cancer，2005，13:85－96.

［9］Kris M G，Roila F，DeMulder P H，et al.Delayed emesis following anticancer chemotherapy［J］.Support Care Cancer，1998，6(3):228－32.

［10］Frisch C，Hasenohrl R U，Mattern C M，et al.Blockage of lithium chloride-induced conditioned place aversion as atest for antiemetic agents:comparison of metoclopramide with combined extracts of Zingiber officinale and Ginkgo biloba［J］.Pharmacol Biochem Behav，1995，52:321－7.

［11］Sharma S S，Kochupillai V，Gupta S K，et al.Antiemetic efficacy of ginger(Zingiber officinale)against cisplatin-induced emesis in dogs［J］.J Ethnopharmacol，1997，57:93－6.

［12］Hickok J T，Roscoe J A，Morrow G R，et al.A phase Ⅱ/Ⅲ randomized，placebo-controlled，double-blind clinical trial of ginger(Zingiber officinale)for nausea caused by chemotherapy for cancer:a currently accruing URCC CCOP cancer control study［J］.Suppportive Cancer Therapy，2007，4(4):247－50.

［13］Yamahara J，Huang Q R，Iwamoto U，et al.Active components of ginger exhibiting antiserotonergic action［J］.Phytother Res，1989，3:70－1.

［14］Abdil-Aziz H，Windeck T，Ploch M，et al.Mode of action of gingerols and shogaols on 5-HT3receptors:binding studies，cation uptake by the receptor channel and contraction of isolated guineapig ileum［J］.Eur J Pharmacol，2006，530:136－43.

［15］Borrelli F，Capasso R，Pinto A，et al.Inhibitory effect of ginger(Zingiber officinale)on rat ileal motilityin vitro［J］.Life Sci，2004，74:2889－96.

［16］Qian Q H，Yue W，Wang Y X，et al.Gingerol inhibits cisplatininduced vomiting by down regulating 5-Hydroxytryptamine，Dopamine and Substance P expression in Minks［J］.Arch Pharm Res，2009，32(4):565－73.

［17］Sharma S S，Gupta Y K.Reversal of cisplatin-induced delay in gadstric emptying in rats by ginger(Zingiber officinale)［J］.J Ethnopharmacol，1998，62:49－55.

［18］Wu K L，Rayner C K，Chuah S K，et al.Effects of ginger on gastric emptying and motility in healthy humans［J］.Eur J Gastroenterol Hepatol，2008，20:436－40.

［19］Wadikar D D，Nanjappa C，Premavalli K S，et al.Development of ginger based ready-to-eat appetizers by response surface methodology［J］.Appetite，2010，55:76－83.

［20］Stewart J J，Wood M J，Wood C D，et al.Effects of ginger on motion sickness susceptibility and gastric function［J］.Pharmacology，1991，42:111－20.

［21］程记伟，白 宇.即刻早期基因c-fos与癫痫关系的研究进展［J］.现代医药卫生，2008，24(2):221－2.

［21］Chen J W，Bai Y.The relationship of c-fos and epilepsy［J］.Mod Med Health，2008，24(2):221－2.

［22］Miller A D，Ruggiero D A.Emeti reflex are revealed by epression of ther immediate-early gene c-fos in the cat［J］.J Neurousc，1994，14(2):871－88.

［23］Billig I，Yates B J，Rinaman L.Plasma hormone levels and central c-fos expression in ferrets after systemic administration of cholecystokinin［J］.Am J Physiol，2001，281(4):1243－55.

［24］Endo T，Minami M，Nakayasu M，et al.Effects of granisetron and vagotomy on c-fos mRNA expression in the rat medulla oblongata as assessed by in situ hybridization［J］.Biomed Res，2004，25:229－35.