酒醅发酵过程中氨基甲酸乙酯与尿素的变化

范文来，徐 岩，史斌斌

(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏无锡214122)

氨基甲酸乙酯(EC，ethyl carbamate)天然存在于发酵食品中［1］，1943 年发现 EC 具有致癌性［2］。早期，世界卫生组织国际癌症研究把EC归为一种可能对人类致癌的物质(2B类)。2007年3月，该机构经过重新分类，已把EC归为2A类致癌物［3－4］。大量文献报道了EC的基因毒性和致癌性，但饮料酒中EC的检测到1985年才引起关注，加拿大官方发现多种饮料酒中EC的含量很高。当年，加拿大设定了饮料酒中EC最高允许浓度，规定佐餐葡萄酒、加强葡萄酒(fortified wine)、蒸馏酒(distilled spirits)、清酒(sake)和水果白兰地(fruit brandy)中EC含量分别不得超过 30、100、150、200、400μg/L［5］。研究表明，饮料酒中EC由尿素或氰化物与乙醇反应产生［5］，主要形成于发酵、加热或蒸馏以及储存过程［6］。尿素公认为是葡萄酒中EC最主要的前体物［5］，在葡萄酒储存过程中EC会继续产生，且随温度的升高生成速度加快［7］，通常控制低于24℃贮存温度避免大量EC的形成［8］。氰化物是威士忌与白兰地酒中EC的前驱物［9］。饮料酒中EC浓度最高的是石果白兰地(stone－fruit brandy)，最高达 22mg/L［5］。我国黄酒中 EC的研究较早［10－11］，白酒中EC的研究是近几年才开始的，通常采用气相色谱－质谱法(GC－MS)［12－14］、二维气相色谱法(MDGC)［15］、顶空固相微萃取(HSSPME)结合 GC－MS［16－17］检测白酒中的 EC，但没有发现发酵过程中固态发酵基质大曲与酒醅检测方法的研究报道。为深入研究白酒发酵过程中EC及其前驱物尿素的变化规律，本研究采用超声萃取处理白酒大曲和酒醅，HS－SPME方法来定量分析白酒大曲和酒醅中EC的含量。通过对白酒大曲和酒醅进行定量分析，确定EC的演化规律;同时对白酒大曲和酒醅中的尿素进行检测，确定EC与尿素之间的相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

内标氨基甲酸丙酯(PC) 上海安谱科学仪器有限公司;氯化钠、磷酸、硫酸、尿素、硫代氨基脲、二乙酰一肟 中国医药集团上海化学试剂公司;实验专用水 超纯水(Milli－Q 系统，Millipore，Badford，MA，USA);白酒大曲和酒醅 由相应白酒厂提供。

气相色谱质谱联用仪(GC 6890N－MSD 5975)美国Agilent公司;固相微萃取自动进样器(MPS2)德国Gerstel公司;固相微萃取头PA Supelco公司;分光光度计 尤尼柯(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 溶液配制 二乙酰一肟(DAM)溶液，浓度2.5×104mg/L，4℃冰箱保存。硫代氨基脲(TSC)溶液，浓度2.5×103mg/L，4℃冰箱保存。酸试剂:准确量取300mL浓磷酸与10mL浓硫酸混合，分别倒入500mL容量瓶中，边倒边用自来水冷却，最后用水定容至液面保持不变。显色剂:按比例DAM溶液∶TSC溶液∶酸试剂 =2.5∶1∶50(V/V/V)混合三种溶液，摇匀后备用。显色剂现配现用。尿素溶液(25mg/L):配浓度较大的母液作为储藏液，稀释得到梯度浓度标准溶液。

1.2.2 EC检测样品预处理 白酒大曲和酒醅的预处理(超声萃取):称量10g大曲(或者酒醅)，添加1%CaCl2(酒醅不添加)，用30mL(酒醅添加20mL)水作为浸提剂，浸泡30min，超声30min(功率60W，超声频率40kHz)。然后在8000r/min于4℃下离心10min，收集上清浸提液。顶空固相微萃取(HSSPME):取8mL的上清浸提液到20mL的顶空瓶中，加入5μL内标PC，加入3g氯化钠。插入萃取头，预热后萃取吸附，然后250℃下解吸5min。

1.2.3 GC－MS方法 GC条件:进样口温度250℃，载气He，流速2mL/min，不分流进样，色谱柱为DBFFAP(60m ×0.25mm ×0.25μm，J＆W Scientific)。升温程序为:50℃恒温2min，以5℃/min的速度升温至170℃，再以 10℃/min的速度升温至 230℃，保持5min。MS条件:EI电离源，电子能量70eV，离子源温度230℃，扫描范围35.00～350.00amu。MS检测器采用SIM模式，特征离子m/z 62用于EC和内标PC两种物质的定量。质谱分析用数据库NIST05a1L。

1.2.4 EC标准曲线绘制 取超纯水8mL，添加梯度浓度的EC标准品，再加入内标溶液，HS－SPME以及GC－MS检测，制作标准曲线。利用内标标准曲线法，以待测物EC峰面积与内标PC峰面积之比为横坐标(x)，待测物EC浓度与内标PC浓度之比值为纵坐标(y)，线性回归，对目标化合物进行定量。

1.2.5 尿素分光光度计测定 参照文献方法［18］，以超纯水作为空白，在比色管中加入待测样品1mL，再加入15mL显色剂，定容到25mL，充分摇匀，于沸水浴(电磁炉烧水)中加热26min，取出于流动的自来水中冷却14min，再于室温下分光光度计比色，波长527nm，光程1cm。

1.2.6 尿素标准曲线绘制 准备7只25mL比色管，依次加入 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3mL 的 25mg/L 尿素溶液，各管再分别加入15mL显色剂，全部定容至25mL，充分摇匀，于沸水浴中加热26min，取出于流动的自来水中冷却14min。迅速取出于室温下分光光度计比色，波长527nm，光程1cm。

以尿素含量为纵坐标，比色结果OD值为横坐标，作尿素－吸光度标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 EC检测方法评价

将一系列不同浓度的标准溶液置于优化好的萃取条件下(萃取温度70℃，萃取时间45min)，加入内标进行标准曲线的绘制，结果详见表1。

表1 酒醅和大曲中EC定量方法的线性及检测限Table 1 Linearity and limit of detection of EC detected in fermented grains and daqu

从表1可以看出，该方法可以检测的EC下限达7.8μg/L，检测上限达 600μg/L，线性范围宽;线性关系良好(R2＞0.99)。由表2可知，准确度(平均RSD 7.51%)、回收率(平均118%)较好。以信噪比等于3为标准，EC的检测限(LOD)1.16μg/L，该方法可用于大曲和酒醅中EC的检测。

表2 酒醅和大曲中EC定量方法的准确度和回收率(n=3)Table 2 Recovery and precision of EC detected in fermented grains and daqu

2.2 尿素检测标准曲线

采用1.2.6的步骤制备标准曲线，得到的标准曲线如表3，可知在0～60mg/L的线性范围内，该方法的线性关系很好(R2＞0.99)。

表3 酒醅和大曲中尿素定量方法线性Table 3 Linearity of urea detectedin fermented grains and daqu

2.3 白酒成品大曲中EC和尿素

对不同类型的大曲进行了分析，结果如表4。

由表4可以看出，不同类型大曲中尿素含量相差比较大。高温曲(发酵温度58～60℃)的三个样品中尿素含量比较低，平均含量243.24mg/kg，超高温曲(发酵温度 65～70℃)和中温曲(发酵温度55～56℃)中尿素的含量则比较高，平均含量分别为512.57mg/kg和475.74mg/kg。这一现象与EC的含量变化类似，即超高温曲与中温曲EC含量高，而高温曲EC浓度较低。

2.4 白酒酒醅中EC和尿素变化

表4 不同类型大曲中EC和尿素含量Table 4 Concentration of EC and urea in different type of Daqu

图1 清香型大与二酒醅发酵过程中尿素与EC变化Fig.1 Changes of urea and EC of fermented grains of light aroma type liquor in the fermentation

2.4.3 兼香型酒醅发酵过程中EC与尿素的变化兼香型酒醅在发酵过程中开始时尿素含量上升，发酵至30d，尿素含量达最大(88.01mg/kg)，然后开始下降，至发酵终了时，尿素浓度下降到79.45mg/kg(见图2)。EC的变化与尿素的变化同步，发酵至30d时，EC达最大值(130.69μg/kg)，然后开始下降，至发酵终了时，EC浓度降至122.89μg/kg。

表5 浓香型大酒醅中尿素与EC变化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

表5 浓香型大酒醅中尿素与EC变化Table 5 Changes of urea and ECin fermented grain of strong aroma type liquor

注:0、2d是指浓香型酒醅堆积的天数，25、30、60d是指发酵时间。

0 2 25 30 60尿素(mg/kg)发酵时间(d)33.70 24.02 32.21 26.63 28.12 EC(μg/kg)＜q.l. ＜q.l. 167.99 149.18 112.12

图2 兼香型酒醅发酵过程中尿素与EC变化Fig.2 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor in the fermentation

比较清香型、浓香型与兼香型三种不同香型白酒，具有如下共同特点:一是出窖(出缸)时，EC浓度在110～130μg/kg，但尿素浓度在 26～80mg/kg。有研究表明，黄酒中尿素含量约在 20～30mg/L［20－21］，高的可达35mg/L［22］;二是EC的增长或下降与尿素的变化基本同步，推测白酒中EC的形成可能是尿素途径，而不同于同是粮食蒸馏酒的威士忌－氰化物途径。

成品黄酒中 EC 含量 116～205μg/L［23］，白酒中EC 浓度在 78～120μg/L(折算成 40%vol)［17］，这一数值低于黄酒中EC浓度。黄酒中EC主要是黄酒发酵结束后煎酒与黄酒贮存老熟阶段产生的。研究发现在黄酒生产用水和糖化液中未检测到EC，米酒、发酵液、煎酒液和成品黄酒中平均含量在8.2、7.9、21.6和52.7μg/kg［24］。从白酒酒醅中 EC 浓度看，这一数值比发酵结束后黄酒中7.9μg/L(发酵液)要高得多。推测这可能与白酒多菌种发酵中菌系比黄酒丰富有关，也与白酒生产中使用小麦、豌豆等高蛋白质含量的原料有关。

2.4.4 兼香型酒醅配料与蒸馏前后EC与尿素的变化 配料后，由于加入高粱，酒醅中尿素与EC浓度均下降，分别下降25.37%和32.08%;蒸馏后，酒醅中尿素和EC浓度比配料后浓度低。蒸馏后，酒醅中尿素和EC浓度分别下降15.37%和13.57%。这主要是粮食的稀释与蒸馏作用引起的。

图3 兼香型酒醅配料、蒸馏前后EC变化Fig.3 Changes of urea and EC of fermented grains from complex aroma type liquor before and after mixed and distillation

3 结论

超声萃取固体基质样品，顶空固相微萃取技术(HS－SPME)结合气相色谱－质谱(GC－MS)检测白酒大曲和酒醅中氨基甲酸乙酯(EC)的方法是一种快速、准确、环境友好的方法，该分析方法线性范围宽，线性关系良好，准确度、回收率较好。通过研究大曲和酒醅中EC和尿素的变化，发现酒醅发酵过程中EC的变化与尿素浓度变化基本同步。

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