亚甲基蓝对肠出血性大肠杆菌O157的光动力杀菌技术研究

唐姝姝，唐书泽，* ，李红爱，范方辉，吴希阳，陈振强

(1.暨南大学食品科学与工程系，广东广州510632;2.暨南大学光电工程系，广东广州510632)

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157是上世纪末新发现的危害严重的新型人类致病菌，能够致人腹泻、出血性结肠炎(HC)，还可在5%～10%的病例中引发溶血性尿毒综合征(HUS)及血栓性血小板减少紫癜(TTP)等严重并发症，严重者可致死亡［1］。该菌对加热的抵抗力比其他肠道菌要强，少数巴氏杀菌也不能将其完全杀灭，在水中可存活数月，在冷藏条件下比在室温条件下能存活更久［2］。近20年来，EHEC O157∶H7引发的食物中毒在世界各地都有不同规模的暴发流行，已经成为全球性的公共卫生问题，对人们的健康构成了巨大威胁［1］。光动力疗法(Photodynamic therapy，PDT)是目前国际上正在发展的一种新技术，它主要利用光激活光敏剂产生光化学效应选择性的杀伤病原微生物，目前已经成功应用于恶性肿瘤的治疗等方面。光动力灭菌技术(APDT)基于光动力作用，是指利用光敏剂能够选择性富集在目标细胞或组织(如各种病源微生物)，并在特定波长的可见光照射情况下生成大量活性氧，进而通过活性氧与多种生物大分子的相互作用，损伤目标细胞组织从而影响其正常生理功能，但不伤害周围细胞和组织的特性，实现对目标微生物有效杀灭的一项新技术［2－4］。亚甲基蓝(Methylene blue，MB)是一种常见的碱性染料，由于其渗透系数高于其他染料，易穿透细胞膜在细菌体内部集中，从而在细菌的细胞膜上染色，于特定波长的光结合产生光动力学效应。在对细菌进行光动力作用前需要将其置于光敏剂中避光孵育，这段时间可以使光敏剂停留在菌体内并聚集，提高光动力作用的杀菌效果［5］。国外从90年代起已开展了基于MB的光灭活血浆中病毒的研究工作，但在微生物方面的应用才刚刚起步［6－7］。MB－APDT 对革兰氏阳性菌有很强的杀伤作用，而其在革兰氏阴性菌中的研究却鲜有报道。革兰氏阴性菌由于具有复杂的细胞壁结构，屏蔽了细胞膜与单重态氧的有效结合，降低了光动力疗法的杀伤作用，使得其比阳性菌更难杀灭［8－9］。本实验选择肠出血性大肠杆菌O157作为实验菌株，通过对各种杀菌条件的探索，提高MB－APDT处理对O157的灭活效果，寻求该技术对革兰氏阴性菌的最佳作用条件。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157菌株 由广州市疾病预防控制中心馈赠;细菌计数培养基、LB液体培养基 均购自青岛海博生物技术有限公司;亚甲基蓝(10g/L) 购自上海红绿光敏剂研究所有限公司。

U21901双光束紫外可见光分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;75W溴钨灯(光功密度200mW/cm2) 北京卓立汉光仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细菌接种及培养 将活化的大肠杆菌的菌悬液以1∶100的比例接种于100mL LB液体培养基中，37℃下振荡培养至对数生长期，离心收集菌体(4000r/min，10min)，弃去上清液，使菌体重新悬浮于0.1mol/mL的磷酸盐缓冲液(PBS)中，并使其OD600=0.5(相当于107CFU/mL左右)。

1.2.2 单因素影响实验 以O157菌落数为指标，分别以MB浓度、光照时间、孵育时间为因素，进行单因素实验。

1.2.2.1 光敏剂浓度实验［10］用PBS稀释MB，加入菌液，配制 MB 终浓度分别为 0、1、5、10、25、50、75mg/L的菌悬液，备用。

将不同浓度 MB的菌悬液于37℃避光孵育10min后进行光照，即在96孔细胞培养板任取一孔，加入200μL菌悬液，37℃避光孵育10min，放在距离溴钨灯光源20cm处光照10min。同时设置不加光敏剂、不孵育且不光照的空白对照组。

1.2.2.2 光照时间实验 将MB浓度为10mg/L的菌悬液于37℃避光孵育10min后进行不同时长的光照，放在距离溴钨灯光源20cm处光照0、5、10、20、30、45、60min。同时设置不加光敏剂、不孵育且不光照的空白对照组。

1.2.2.3 孵育时间实验 将MB浓度为10mg/L的菌悬液于 37℃ 分别避光孵育 0、1、5、10、15、20、30min后进行光照。同时设置不加光敏剂、不孵育且不光照的空白对照组。

1.2.3 响应曲面法实验设计 根据Box－Behnken的中心组合实验设计原则，选择3因素3水平的响应面分析方法，以MB浓度、光照时间、孵育时间为主要考察因素，各因素水平及编码如表1所示。

1.2.4 细菌平板菌落计数 将1.2.2处理所得的菌悬液均以1∶10梯度稀释后，每个梯度各取100μL于细菌平板菌落计数培养基平皿中，37℃生化培养箱中恒温培养24h后进行平板菌落计数。为了使图表更清晰，菌落计数的结果以对数logCFU(mL)表示，并绘制相应的折线图。实验重复3次，取平均值。

表1 响应面实验因素水平表Table 1 The design of response surface methodology

1.2.5 统计分析 用SPSS17.0统计软件进行数据处理，结果以平均值±标准差表示，显著性差异用t检验，p＜0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 MB－APDT对肠出血性大肠杆菌O157杀伤作用的单因素实验

2.1.1 MB浓度对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响 不同浓度MB下肠出血性大肠杆菌O157的菌落数见图1。当MB浓度为1mg/L和5mg/L时，MB－APDT虽对细菌有一定的杀伤作用，但是杀伤效果不理想。MB浓度为10mg/L以上，O157的菌落数减少了3个对数以上，即能使99.9%以上的O157失活。可见，光照条件下，在MB的一定浓度范围内，O157的菌落数随着MB浓度的增大而减少。而当MB浓度增加到一定程度，会在细菌细胞内外形成动态平衡，阻碍MB进一步进入细菌细胞，反而降低了光动力的杀伤效果［11］。

图1 MB浓度对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响Fig.1 Effect of MB concentrations on LogCFU of EHEC O157

2.1.2 光照时间对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响 不同光照时间下肠出血性大肠杆菌O157的菌落数见图2。在其他条件相同的情况下，光照时间不同，MB－APDT的杀菌效果也不同。光照时间由5min增加至60min，菌落数呈现先显著减少后略有增加的趋势;在光照时间为30min时，O157的菌落数最少约为1.45个对数。

2.1.3 孵育时间对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响 不同孵育时间下肠出血性大肠杆菌O157的菌落数见图3。可见，随着孵育时间的延长，开始时菌落数逐渐减少，至15min时达到最低点2个对数，再继续延长孵育时间超过15min，菌落数开始略上升。

表3 回归模型方差分析及显著性检验Table 3 Reliability equation and significance test of the model

图2 光照时间对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响Fig.2 Effect of illumination time on LogCFU of EHEC O157

在相同的MB浓度及光照时长下，孵育时间过短，MB与细菌细胞结合不完全，未能在菌体内集中，不利于光动力作用;但继续延长孵育时间至15min以上时，菌落数不会继续下降反而略有上升，这是由于MB与细菌细胞结合完全后，MB已在菌体内达到饱和，继续延长孵育时间反而不利于MB进入，从而降低了 MB－APDT 的杀伤效果［12］。

图3 孵育时间对肠出血性大肠杆菌O157菌落数的影响Fig.3 Effect of incubation time on the LogCFU of EHEC O157

2.2 响应面分析MB－APDT优化实验

2.2.1 模型方程的建立与显著性检验 按照Box－Behnken实验设计的统计学要求，根据实验因素和水平的要求，设计17次实验，实验结果如表2所示。

表2 响应面实验设计与结果Table 2 The experiment design and result of Box－Behnken response surface

应用Design Expert 7.0软件，对表2中的数据进行多元回归拟合，可得O157菌落数(Y)与MB浓度(A)、光照时间(B)、孵育时间(C)之间的多项二次回归方程为:Y=1.34－0.056A－(1.000E－002)B－0.081C－0.065AB+0.028AC－0.025BC+0.071A2+0.13B2+0.061C2。

该模型的方差分析和显著性检验见表3。该模型p=0.0155＜0.05，表明二次多元回归模型回归效果显著，不同处理间的差异显著，失拟项p=0.0349＜0.05显著;该模型的决定系数为0.9833，表明98.33%的实验数据的可变性可用此模型解释，仅有总变异的1.67%不能用此模型来解释;回归模型的拟合度好，预测值与实验值高度相关。

二次多项式的回归方程系数的显著性检验表明，因素A和因素B对响应值的线性效应显著，因素C对响应值的线性效应极显著;因素AB对响应值的交互影响显著，AC和BC对响应值的交互影响不显著;说明3个因素均不同程度的对响应值产生了极显著或显著的影响。

2.2.2 O157菌落数响应曲面分析 三因素交互作用的响应面曲面图见图4～图6。由此可分析评价任何两因素对0157菌落数的交互影响，以确定最佳的因素水平范围。

图4 MB浓度与光照时间交互作用影响Fig.4 Effect of MB concentration and illumination time on the CFU of EHEC O157

图5 MB浓度与孵育时间交互作用影响Fig.5 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

图6 MB浓度与孵育时间交互作用影响Fig.6 Effect of MB concentration and incubation time on the CFU of EHEC O157

由图4知，MB浓度和光照时间相互作用对0157菌落数有显著影响。当光照时长小于27.5min，随着MB浓度的增加，O157菌落数呈现先下降后略微上升的趋势;当光照时间较长，随着MB浓度的增加O157菌落数会呈现下降的趋势。在MB浓度不变的条件下，随着光照时间的延长，0157菌落数呈现先下降后上升的趋势。

图5显示，MB浓度和孵育时间对O157菌落数无显著影响。MB浓度不变时，随着孵育时间的延长，O157菌落数呈现下降的趋势，且当孵育时间较长时，O157菌落数随MB浓度变化不大;孵育时间不变时，随着MB浓度的增加，O157菌落数也呈现下降的趋势。

由图6知，光照时间和孵育时间对O157菌落数的影响不显著。孵育时间不变时，随着光照时间的延长，O157菌落数呈现先下降后上升的趋势;在光照时间不变的条件下，对着孵育时间的延长，O157菌落数呈现下降的趋势。

由Design Expert 7.0软件得到的优化条件的处理，确定最佳的反应条件为:MB浓度24.08mg/L、光照时间27.66min，孵育时间19.00min，预测值为1.00。在相应的条件下，实验测得值为1.03，与理论预测值的相对误差为3%，与预测值接近，达到了优化条件的目的。

3 结论

MB浓度，光照时间及孵育时间在光动力灭菌技术中对O157菌落数都有显著影响。应用APDT杀灭肠出血性大肠杆菌O157的最佳反应条件参数为:MB浓度 24.08mg/L、光照时间 27.66min，孵育时间19.00min，O157菌落数理论值为1.00，实验值为1.03。

本课题组前期的研究工作已经证实光动力杀菌技术对曲霉孢子［13］、革兰氏阴性菌金黄色葡萄球菌［14］及单核细胞增多性李斯特菌［15］具有良好的灭菌效果，本实验进一步优化了应用MB－APDT杀灭革兰氏阴性菌肠出血性大肠杆菌O157的反应条件。根据以往的相关灭菌技术，能使细菌菌落总数减少2～3个数量级以上的灭菌技术，即可以进行适当的改善后应用于食品工业的微生物控制中［16］。因此，光动力杀菌技术也有可能被开发成一种非常有效的杀灭革兰氏阴性菌的技术应用于食品安全领域。

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