壳聚糖对Nisin抑菌稳定性的影响研究

曾清清，张立彦，刘启莲

(华南理工大学轻工与食品学院，广东广州510640)

乳链菌肽(Nisin)，是由属于N型血清的某些乳酸链球菌(lactococcuslactis)在代谢过程中合成和分泌的具有很强杀菌作用的小肽，由34个氨基酸残基组成［1］。目前，Nisin主要是作为食品防腐剂和抑菌剂在食品工业和医药业得到广泛应用［2－3］。温度和pH会显著影响Nisin的活性［4］，在储放过程中Nisin也在不断失活，Nisin的这些特性都将限制其应用。因此有必要研究改善Nisin抑菌活性的措施或保护物质，从而提高其抑菌稳定性，延长其抑菌期限。壳聚糖(chitosan)是甲壳素经脱乙酰处理得到的生物大分子，可用于保护蛋白质等的生物活性，但尚未见有关于壳聚糖保护Nisin活性的报道。为此，本实验研究了不同温度和pH下壳聚糖对Nisin的保护效果，并结合红外光谱和DSC的测定，进一步探讨了其对Nisin活性的影响机制。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

藤黄微球菌(Micrococcus luteus) CICC10209，广州环凯微生物科技有限公司;Nisin 食品级，浙江银象生物工程有限公司;壳聚糖 分析纯，天津市华苑产业区鑫茂科技园。

Model 752型紫外可见分光光度计 上海现科分光仪器有限公司;LDZX－30FA型手提式不锈钢蒸汽消毒器 江阴顶江机械设备有限公司;DF－101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限公司;BSD－150型水浴恒温振荡培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;Nicolet 560型红外光谱分析仪 Nicolet Company;Q200型差式扫描量热仪TA Company。

1.2 实验方法

1.2.1 Nisin 效价的测定［5］

1.2.1.1 培养基的配制 斜面培养基:蛋白胨5g/L，牛肉膏3g/L，氯化钠 5g/L，琼脂 20g/L，pH7.0;种子培养基:蛋白胨 5g/L，牛肉膏 3g/L，氯化钠 5g/L，pH7.0;CM检测培养基:Tween20与水(体积比1∶1)混合物2g/L，胰蛋白胨8g/L，葡萄糖5g/L，氯化钠5g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氢二钠2g/L，pH6.8。

1.2.1.2 培养方法 种子培养:藤黄微球菌菌种活化后接至斜面培养基，33℃培养1～2d，至斜面长好，将长好的斜面用无菌竹签刮至100mL种子培养基中，33℃，150r/min摇床培养6h;检测培养:将培养好的种子液以10%(体积分数)的接种量接至50mL CM检测培养基中，加入适量经热处理的Nisin溶液，33℃，150r/min摇床培养5h，测定Nisin效价，每个实验做3个平行样，取平均值。

1.2.1.3 Nisin效价的测定 分光光度法［5］。

1.2.1.4 效价损失率的计算:

式中:C1:未经处理时Nisin的效价;C2:经过处理后Nisin的效价。

1.2.2 处理方法

1.2.2.1 溶液的配制 Nisin标准溶液:准确称取10mg Nisin标准品(103IU/mg)，溶于10mL 0.02mol/L HCl中，配制成103IU/mL Nisin标准溶液备用;壳聚糖溶液:准确称取1.0g壳聚糖，加1%的冰乙酸溶液溶解定容至100mL，配制成10g/L的壳聚糖溶液。

1.2.2.2 壳聚糖存在情况下pH及温度对Nisin抑菌能力的影响 在Nisin标准溶液中分别加入与Nisin质量的1%相当的壳聚糖溶液，分别调节至不同的pH(2.0、4.0、5.5、6.0、6.5、6.8)，然后分别在不同温度(30、45、60、75、90、110、121℃)下保持 20min，测定其效价。

1.2.2.3 壳聚糖浓度对Nisin抑菌能力的影响 在Nisin标准溶液中分别加入与Nisin质量的0、0.3%、0.5%、1.0%、1.5%相当的壳聚糖溶液，分别在常温(pH2.0)、85℃ (pH4.0)、121℃ (pH6.5)下处理20min，测定其效价。

1.2.3 红外光谱测定 取一定量样品与KBr混合压片，采用红外光谱仪在扫描范围为400～4000cm－1内进行光谱扫描，分辨率为4cm－1。

1.2.4 差式扫描量热分析 称量液体样品(6±0.2)mg于铝盒中压片，用DSC对样品进行测定，测定参数:扫描温度范围为 20～200℃，升温速率为10℃·min－1，以 99.999% 高纯氮气作为载气，流速25mL·min－1。

2 结果与讨论

2.1 pH和温度对Nisin抑菌稳定性的影响

由图1可知，pH和温度对Nisin的抑菌能力均有显著影响。同一温度下，Nisin效价损失率随着pH的升高而升高;而同一pH下，Nisin效价损失率也随着温度的升高而升高，这表明Nisin溶液的抑菌能力随着pH或温度的不断升高而不断降低，其抑菌活性减弱。这可能是因为Nisin是由34个氨基酸残基组成的多肽化合物，氨基酸残基及其作为抗菌活性分子的二聚体或是四聚体的结构在高温下遭到了破坏，从而影响了Nisin作用藤黄微球菌的效果。同时pH升高会使Nisin的溶解性和稳定性降低，影响Nisin活性中心上必需基团的解离程度，活性也随之降低［6－7］。当温度为 30℃时，随着 pH 的不断上升，其效价损失率由原来的26.2%升高至77%，说明pH显著影响Nisin的活性，抑菌作用得到抑制，但还具有一定的活性;但当温度为121℃，pH由2.0上升到7.0时，其效价损失率由原来的26.2%升高至100%，说明在高温条件下处理，pH的升高将显著影响Nisin活性，且可引起其完全失活，这可能是因为在高pH时，Nisin分子内部氢键断裂，以其内部的脱氢残基易发生反应形成多分子共聚物，同时高温也促进了分子构象的变化，这与江芸［4］的研究结果一致。

图1 pH和温度对Nisin抑菌能力的影响Fig.1 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin

2.2 壳聚糖对Nisin抑菌稳定性的影响

2.2.1 壳聚糖存在情况下pH和温度对Nisin抑菌能力的影响 由图2可知，在1%壳聚糖存在的条件下，Nisin的效价损失率随pH的升高先保持不变而后逐渐升高。当温度低于90℃时，在pH2.0～6.0的范围内，Nisin效价损失基本保持不变，pH大于6.0后，Nisin效价损失随着pH的升高而急剧升高;但在近中性pH时，壳聚糖的溶解度降低，进而对Nisin的保护作用也随之降低。此外，添加1%壳聚糖后，在pH2.0、4.0、5.5时，温度对Nisin的效价损失基本没有影响。当pH6.0，温度低于90℃时，Nisin由于受到壳聚糖的保护，效价损失不大，但当温度大于90℃时，Nisin效价损失则随着温度增大而迅速增大。在近中性条件下(pH6.5、6.8)，温度低于 80℃时，温度对Nisin效价影响较小;但当温度高于80℃时，Nisin效价损失则随着温度升高而快速上升，此时壳聚糖对Nisin的保护作用减弱。

图2 添加壳聚糖时，pH和温度对Nisin抑菌能力的影响Fig.2 Effect of pH and temperature on the antibacterial activity of Nisin with chitosan added

结合图1～图2可知，在壳聚糖存在的情况下，Nisin的效价损失率比未添加时总体都有大幅度的下降，说明壳聚糖的添加对Nisin的抑菌稳定性具有较显著的保护作用。这可能是因为壳聚糖分子中含有多个亲水性基团，分子空间大，能结合大量的水分，具有很强的吸水性，能优先与水结合，使得Nisin分子的溶剂化层水减少，进而导致溶剂化层表观体积的减少，可移动性降低，使得Nisin分子结构结合得更加紧密，从而能够抵御外界环境的影响，保护了Nisin 分子结构的构象稳定性［8－10］。

2.2.2 壳聚糖浓度对Nisin抑菌能力的影响 如图3所示，随着壳聚糖浓度的增加，Nisin的效价损失率呈现出逐渐降低的趋势(pH2.0，常温除外)。pH2.0、常温条件下，Nisin的效价损失率基本保持在0%的水平。pH4.0、85℃的条件下，无壳聚糖添加时Nisin效价损失率为37.6%，当添加0.3%浓度的壳聚糖时，Nisin效价损失率显著降低到4%，说明此时添加的壳聚糖对Nisin的效价起到了较大的保护作用;随着壳聚糖浓度的继续升高，Nisin的效价损失率也继续降低，但趋势变得平缓，到1%的浓度时，Nisin已经基本无效价损失。在高温、中性条件下(121℃、pH6.5)，当壳聚糖浓度低于1%时，Nisin效价损失率随着壳聚糖浓度的升高而降低，当壳聚糖浓度大于1%时，Nisin效价损失率随着壳聚糖浓度的升高反而略有升高，这可能是由于壳聚糖浓度过高，溶液变得很粘稠，反而对菌体具有一定的保护作用，表现为Nisin的效价损失率升高。

表1 壳聚糖对Nisin红外光谱的影响Table 1 Effect of chitosan on Infrared spectrum of Nisin

图3 壳聚糖浓度对Nisin抑菌能力的影响Fig.3 Effect of the concentration of chitosan on the antibacterial activity of Nisin

2.3 壳聚糖对Nisin抑菌活性影响的机制研究

2.3.1 壳聚糖对Nisin红外图谱的影响 添加1%壳聚糖的 Nisin红外图谱如图4(样品均在 pH6.5，115℃下处理15min)所示。添加1%壳聚糖对Nisin红外图谱的变化如表1。

由图4可知，添加了1%壳聚糖的Nisin红外光谱图中，除了A、B、C、D四个吸收峰外，出现了其他吸收峰，分别是C－O伸缩振动峰和C－H面向弯曲振动峰。而A、B、C、D四个吸收峰是液态水的吸收峰，说明在pH6.5，115℃下处理15min后，Nisin的活性基团受到破坏，活性已经完全丧失。而在添加了壳聚糖的Nisin红外光谱图出现了新的吸收峰，表明它与Nisin分子间存在比较强的分子间作用力，形成了C－O、C－H键的结合，与 Nisin分子形成了氢键，C－O、C－H之间的作用增强，从而保护了Nisin原有的分子结构和活性基团，对稳定Nisin的空间构象、提高其稳定性有着明显的作用。

图4 添加壳聚糖的Nisin红外光谱图Fig.4 Infrared spectrogram of Nisin with chitosan added

由表1所示可知，O－H伸缩振动峰、O－H摇摆振动峰出现了右移，且均向低波数方向有较大的移动。说明壳聚糖与Nisin之间形成了氢键，分子间缔合作用和水合作用增强。而氢键的形成能够抑制pH和温度对Nisin所带来的负面影响，防止其结构受外界环境作用而遭受破坏。这种分子间的作用力增加了Nisin空间结构的稳定性。

2.3.2 壳聚糖对Nisin热稳定性的影响 当添加了1%壳聚糖的 Nisin在pH4.0、85℃加热20min后，其效价损失率分别由未添加时的31%降到了0.3%，说明壳聚糖对Nisin的稳定性有着极强的保护作用(图1、图 2)。由 DSC图谱可知，经 pH4.0、85℃ 加热20min后，Nisin的热变性温度由pH2.0、常温下处理的172.78℃降至现在的152.13℃。其可能的机制是pH与热处理相结合导致Nisin内部疏水基团更多暴露在外，Nisin的空间结构遭到破坏，影响到活性基团的作用效果［11］。而壳聚糖的加入将变性温度提高到了177.62℃。表明其对Nisin空间构象的稳定性有着显著的保护效果。壳聚糖的羟基能够替代水分子，同Nisin分子的某些基团存在着氢键结合，且这种结合明显地提高了Nisin分子的热变性温度。

图5 不同条件处理20min后的Nisin差示扫描量热谱图Fig.5 Thermogram of Nisin in different conditions for 20min

3 结论

本实验结果表明壳聚糖可以显著改善Nisin的抑菌稳定性。在壳聚糖存在的条件下，Nisin的效价损失率随温度及pH的升高先保持不变而后显著增加，在不同的温度及pH条件下，其保护效果有所差异。壳聚糖浓度在1%时改善效果最好。红外光谱分析显示，添加壳聚糖的Nisin红外光谱图表明壳聚糖与Nisin分子形成了氢键结合，稳定了Nisin的构象。DSC图谱分析显示，添加壳聚糖可以提高Nisin的变性温度，改善其热稳定性，从而改善了其抑菌稳定性。

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