杜仲内生真菌代谢产物对大肠杆菌的作用机理研究

姜交龙，张 涛，江 波，沐万孟，缪 铭

(江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122)

杜仲(Eucommia ulmoides Oliv)始载于《本草纲目》，是一种落叶乔木，为单科单属单种的稀有刁遗植物，有“活化石植物”之称，是我国传统的名贵中药材，属于国家二类保护植物［1］。研究表明，杜仲各组织中含有如绿原酸、京尼平甙、桃叶珊瑚甙等成分，具有抗氧化、抗菌、抗病毒等药理作用［1－3］。植物内生真菌是指生长在健康植物体的根、茎及叶等组织中的细胞间隙或者细胞内的一类真菌，是植物微生态系统的重要组成部分［4－6］。内生真菌几乎存在于所有目前已经研究过的植物之中。近年来的研究发现:生活在植物体的内生真菌能产生与宿主相同或者相似的具有生理活性的代谢产物［7－9］。因此，开发和利用植物内生真菌在保护植物物种资源、探索新的产物等方面都有着重要的意义。本文以从杜仲中筛选到的一株具有较高抑菌活性的内生真菌Y18为出发菌株，研究其代谢产物对大肠杆菌细胞膜通透性、全细胞蛋白质以及核酸结构等方面的影响，为内生真菌资源开发提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

碘化丙啶(PI) 北京泛博生化公司;乙酸乙酯等 分析纯;大肠杆菌 本实验室保存;大肠杆菌培养 LB培养基(蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、水1L);真菌活化培养 PDA培养基(马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g，水1L);发酵培养 察氏培养基(蛋白胨 10g、蔗糖 30g、K2HPO41g、KCl 0.5g、MgSO40.5g、FeSO40.01g、水 1L);杜仲内生真菌 Y18自行筛选，分离步骤［6－7］:取健康的杜仲叶，洗净晾干，在无菌的条件下用75%的乙醇浸泡3min，然后用无菌水漂洗;再用2%的NaClO溶液漂洗2min，最后用无菌水漂洗3次，风干;将表面消毒处理后的杜仲叶剪成1cm左右的小块，加入到含有青霉素的PDA培养基内，28℃下培养，待切口处长出菌丝，挑至新鲜的PDA培养基中，采用菌丝顶端纯化法逐步纯化。

BD FACS Calibur流式细胞分选仪 美国BD公司;NICOLET NEXUS 470傅里叶变换红外光谱仪美国Thermo Electron;YSI3200电导仪 美国YSI。

1.2 实验方法

1.2.1 内生真菌Y18代谢产物制备 将内生真菌转接于 PDA固体培养基，28℃活化2d，然后接种于250mL三角瓶中(含PDA液体培养基50mL)，28℃，150r/min培养3d，作为种子培养基。以5%(v/v)接种量转入500mL三角瓶中(含察氏培养基200mL)，28℃，150r/min培养7d。发酵结束后，过滤除去菌丝体。滤液用等体积的乙酸乙酯分3次萃取，合并有机相，于旋转蒸发仪上浓缩至浸膏，60℃烘干称重，用无菌水溶解制成100mg/mL，备用。

1.2.2 Y18 代谢产物对细胞膜渗透性的影响［10－11］取对数生长期的大肠杆菌，4℃、6000r/min离心3min。用5%的葡萄糖溶液洗涤2次，重悬，分成多个等分备用。取4mL配好的菌悬液与1mL Y18代谢产物作用一段时间，离心取上清液测电导率。0min时的电导率记为L1，作用一段时间后记为L2;将4mL菌悬液与1mL蒸馏水煮沸5min，冷却离心取上清液，测电导率为L0。相对电导率为:(L2－L1)/L0。

1.2.3 流式细胞仪分析细菌细胞膜完整性 将培养至对数期的大肠杆菌4℃、6000r/min离心3min，用0.85%的无菌生理盐水洗涤2次，重悬、稀释至菌体浓度为108～109cfu/mL左右，备用。取4mL菌液加入1mL Y18代谢产物，37℃培养，以生理盐水为阴性对照。在处理前后的样品中均加入PI至终浓度为50μg/mL，37℃避光培养30min 后，4℃、6000r/min 离心3min，用无菌生理盐水洗涤2次除去过量的PI，用流式细胞仪 FACS Calibur检测［12］。

1.2.4 全细胞蛋白变性情况分析 样品处理方法同1.2.3。取500μL样品平铺于ZeSe晶体片上，在常温下烘干，使其形成一层均匀的菌膜。使用FT－IR光谱检测仪进行检测，检测方法为衰减全反射法。操作参数为:检测波数范围为4000～500cm－1，分辨率4cm－1，扫描次数32次。红外光谱采用OMNIC软件进行分析［13－16］。

2 结果与讨论

2.1 Y18代谢产物对大肠杆菌细胞膜渗透性的影响

Y18代谢产物对大肠杆菌细胞膜渗透性的影响如图1所示，作用4h后，相对电导率增大了16.22%，说明菌悬液中的离子浓度变大，推测大肠杆菌细胞膜的通透性受到了影响，细胞内离子的泄漏，从而使得相对电导率增大。

2.2 流式细胞仪分析细菌细胞膜完整性

图1 Y18代谢物对大肠杆菌菌悬液电导率的影响Fig.1 Effect of the metabolites of Y18 on the relative electric conductivity

PI是一种DNA结合性染料，它可以锲入双链核苷酸中，使其在635nm附近发射红色荧光而被流式细胞仪检测。PI无膜通透性，不能透过完整结构细胞膜。因此，PI标记的细胞可以视为细胞膜损伤的细胞［12］。由图2可知，Y18代谢产物处理前 E.coli(图a)PI标记为阴性，表明处理前E.coli细胞膜完整。经过Y18代谢产物处理后(图b～图d为分别处理1、2、4h)，E.coli细胞不同程度被 PI染色，表明Y18代谢产物破坏了细胞膜的完整性，细胞膜通透性增强，PI进入细胞内部，从而与DNA结合，被FCM检测到荧光。由图3可知，经过4h后，阳性细胞的比例达到25.31%。

图2 Y18代谢物处理的E.coli PI染色FCM荧光直方图Fig.2 The fluorescence historgrams of E.coli cells stained by PI in the metabolites treatments

2.3 红外光谱二阶导数处理

FT－IR光谱技术作为一种综合检测细菌生理状态的有效方法，近年来得到广泛地应用［13－15］。图4是处理前后大肠杆菌的红外图谱。由图可知，处理前后图谱的变化微小，从原始红外图谱中无法准确分辨出峰位的变化。通常要对其进行处理，解析图谱中包含的信息。常用的数据处理方法有二阶导数处理和去卷积处理［15－16］。

图3 Y18代谢物处理后E.coli PI阳性细胞比例Fig.3 The percentage of PI－stained E.coli in the metabolites treatments

图4 处理前后大肠杆菌红外图谱Fig.4 Representative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

图5a是大肠杆菌在1700～1600cm－1下的二阶导数图谱。在红外光谱中，1700～1600cm－1代表蛋白物质酰胺 I带 C=O伸缩振动。其中，1682cm－1和1674cm－1的峰代表 β 转角，1660cm－1处的峰代表无规转曲，1644cm－1的峰代表 α 螺旋，1638cm－1和1630cm－1的峰代表 β 折叠［15］。由图5a可见，处理后大肠杆菌细胞蛋白质结构发生变化，其中全细胞蛋白β折叠(1638cm－1和1630cm－1)变化得最为明显;图 5b 中，处理前后在 2957、2919、2872cm－1波数处发生了明显的变化，这三处吸收峰分别代表着CH3反对称伸缩振动、CH2反对称伸缩振动以及CH3对称伸缩振动，主要反映的是细胞膜的变化。这也进一步说明了处理后大肠杆菌细胞膜结构被破坏;图5c中1220、1120cm－1的吸收峰发生了明显的变化，这两处的峰分别代表着核酸骨架中的P=O反对称伸缩振动和C－C反对称伸缩振动，主要反映了大肠杆菌细胞核物质结构的变化，说明处理后大肠杆菌细胞内的核酸物质遭到一定程度的破坏。通过对二阶导数谱图分析可知，处理后的大肠杆菌细胞膜、蛋白质和核酸结构均遭到一定的破坏。

2.4 全细胞蛋白变性情况分析

从二阶导数谱图中可以看出，处理后大肠杆菌全细胞蛋白结构发生了变化，其中蛋白 β折叠(1638cm－1和1630cm－1)变化得最为明显。为了进一步对全细胞蛋白变性情况进行定量分析，采用PeakFit软件对酰胺Ⅰ带进行拟合［15－16］。

图6左图表示了处理前后红外原始图谱(上)、二阶导数图谱(中)和去卷积图谱(下)。二阶导数图谱的峰形向下，去卷积图谱峰形向上。结合两种谱图共同分析，当某个波数下在两图谱中都有吸收峰对应时，说明此吸收峰的可信度较高。根据文献报道［14－16］，可以总结蛋白质酰胺Ⅰ带区 β 转角(1674、1683、1688cm－1)、无规卷曲结构(1660、1667cm－1)、α螺旋结构(1644、1652cm－1)和 β 折叠结构(1609、1618、1624、1630、1635cm－1)及对应的吸收峰波数。通过图6可知，大肠杆菌在处理前后二阶导数图谱和去卷积图谱对应较好，可以明显的分辨出上述12个吸收峰。

图5 处理前后大肠杆菌二阶导数图谱Fig.5 Representative second－derivative FT－IR spectra of control and treated samples of E.coli

结合二阶导数谱和去卷积谱，通过PeakFit软件对酰胺Ⅰ带进行拟合［15］。结果如表1所示，蛋白结构变化主要是β折叠增加，由处理前的34.60%增加到41.47%，变化最为明显。α螺旋、无规卷曲、β转角结构均有降低，其中，无规卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最为明显。

表1 处理前后对大肠杆菌蛋白质酰胺Ⅰ带二级结构的定量分析Table 1 Quantitative estimation of the secondary structures of proteins of control and treated samples of E.coli

3 结论

图6 处理前后大肠杆菌酰胺Ⅰ带二阶导数去卷积谱以及拟合谱图Fig.6 The second－derivative spectra and the amideI of protein fitting bands of control and treated samples of E.coli

本文通过对大肠杆菌细胞膜通透性、全细胞蛋白质以及核酸结构等检测，分析杜仲内生真菌Y18代谢产物对大肠杆菌作用的机理。通过上述实验，可以得出如下结论:内生真菌Y18代谢产物对大肠杆菌细胞膜影响比较明显。处理4h后，大肠杆菌菌液相对电导率为16.22%，PI阳性细胞的比例达到25.31%。PI是一种DNA结合性染料，PI无膜通透性，不能透过完整结构细胞膜，因此，PI阳性细胞表明其细胞膜受到损伤。细胞膜的损伤导致细胞内物质流出，所以相对电导率增大。从二阶导数谱中可以看出，全细胞蛋白质结构发生了明显的变化。蛋白结构变化主要是β折叠增加，由处理前的34.60%增加到41.47%;α螺旋、无规卷曲、β转角结构均有降低，无规卷曲由21.80%下降到18.67%，下降最为明显。从二阶导数谱中可以看出，1220cm－1和1120cm－1的吸收峰发生了明显的变化，这两处的峰分别代表着核酸骨架中的P=O反对称伸缩振动和C－C反对称伸缩振动，主要反映了大肠杆菌细胞核物质结构的变化。

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